Имунолошке студије у урологији

Прописивање имунограма уролошком пацијенту значи да лекар сумња на присуство поремећаја у имунолошком систему. Рекурентне бактеријске, вирусне, гљивичне инфекције, алергијске манифестације, системске болести могу бити знаци ових поремећаја, које карактерише низ синдрома (инфективни, онколошки, алергијски, аутоимуни, лимфопролиферативни). Један пацијент може имати неколико синдрома. На пример, хроничне инфективне болести (инфективни синдром) могу изазвати имунодефицијенцију, а имунодефицијенција се може манифестовати као предиспозиција за инфективне и онколошке болести (онколошки синдром). Предиспозиција за инфекције може се јавити на позадини секундарне имунодефицијенције, која се развила као резултат лимфопролиферативне болести, као што је леукемија. Постоје три главне групе патолошких промена у имунолошком систему:

• квантитативни или функционални недостатак једне или друге везе имуног система, што доводи до развоја имунодефицијенције;
• поремећај у препознавању антигена од стране имуног система, што доводи до развоја аутоимуних процеса;
• хиперреактивни или „перверзни“ имуни одговор, који се манифестује развојем алергијских болести.

Постоје скрининг (тестови нивоа 1) и разјашњавајући (тестови нивоа 2) методе имунодијагностике. Прве постоје да би се забележили поремећаји у имунолошком систему, друге - да би се утврдили механизми који су укључени у њихову имплементацију у сврху даље имунокорекције.

Б-ћелијски имунитет

Методе скрининга

• Одређивање релативног и апсолутног броја Б-лимфоцита помоћу имунофлуоресценције или проточне цитофлуорометрије са моноклонским антителима на Б-ћелијске антигене (CD19, CD20, где је CD кластери диференцијације). Нормалан садржај Б-лимфоцита код одраслих је 8-19% од укупног броја леукоцита или 190-380 ћелија/μl. Повећање садржаја Б-лимфоцита јавља се код акутних и хроничних бактеријских и гљивичних инфекција, хроничних болести јетре, системских болести везивног ткива, хроничне лимфоцитне леукемије и мијелома.
• Одређивање концентрације неспецифичних имуноглобулина (F, M, G, E) једноставном радијалном имунодифузијом, нефелометријом или турбометријом, радиоимунолошким тестом или ензимским имунотестом (ELISA). Норме за одрасле: имуноглобулин (Ig) A 0,9-4,5 г/л. IgM 03-3,7 г/л. IgG 8,0-17 г/л. Повећање концентрације имуноглобулина јавља се у истим патолошким стањима у којима долази до повећања садржаја B-лимфоцита. Смањење концентрације имуноглобулина јавља се код конгениталне хипогамаглобулинемије, неоплазми имуног система, уклањања слезине, губитка протеина, болести бубрега или црева, лечења цитостатицима и имуносупресивима.

Методе разјашњавања

• Одређивање циркулишућих имуних комплекса у крви селективном преципитацијом у полиетилен гликолу, а затим спектрофотометријским испитивањем густине (нормално 80-20 U). Повећање циркулишућих имуних комплекса је типично за акутне бактеријске, гљивичне, вирусне инфекције, аутоимуне, имунокомплексне болести, серумску болест, алергијске реакције типа 3;
• Одређивање специфичних имуноглобулина у крви у односу на бактеријске и вирусне антигене, дезоксирибонуклеинску киселину (ДНК) код аутоимуних болести, детекција антиспермалних (аутоимуна неплодност) и антиреналних антитела (пијелонефритис и гломерулонефритис) радијалном имунодифузијом или ELISA методом.
• Одређивање антиспермалних антитела у сперми [MAR тест (мешана антиглобулинска реакција)], нормалан - негативан резултат.
• Одређивање концентрације имуноглобулина у урину ради диференцијалне дијагнозе између пијелонефритиса и гломерулонефритиса (селективност протеинурије).
• Одређивање садржаја IgE у соку простате у сврху дијагностиковања алергијског простатитиса коришћењем методе радијалне имунодифузије или ELISA.
• Проучавање одговора у реакцији бластне трансформације Б-лимфоцита на митоген Б-ћелија (митоген покевеед за стимулацију реакције бластне трансформације Б-лимфоцита у присуству Т-лимфоцита), чија је нормативна вредност 95-100%.

Т-ћелијска веза имунитета

Методе скрининга

• Одређивање релативног и апсолутног броја зрелих CD3 Т-лимфоцита имунофлуоресцентном реакцијом или проточном цитофлуорометријом коришћењем моноклонских анти-CD3 антитела. Норма за одрасле је 58-76% или 1100-1700 ћелија/μl. Смањење броја Т-лимфоцита је показатељ инсуфицијенције ћелијске везе имунитета. Ово је типично за неке секундарне и примарне имунодефицијенције (хроничне бактеријске и вирусне инфекције: туберкулоза, синдром стечене имунодефицијенције, малигни тумори, хронична бубрежна инсуфицијенција, повреде, стрес, старење, неухрањеност, лечење цитостатицима, излагање јонизујућем зрачењу). Повећање броја Т-лимфоцита се јавља на позадини имунолошке хиперактивности или код лимфопролиферативних болести. Код упале, број Т-лимфоцита се прво повећава, а затим смањује. Одсуство смањења Т-лимфоцита указује на хронични инфламаторни процес.
• Процена субпопулација лимфоцита.
  • Одређивање броја Т-хелпера (анти-CD4 антитела). Нормално 36-55% или 400-1100 ћелија/mcl. Повећање броја ових ћелија се јавља код аутоимуних болести, Валденстромове болести, активације антитрансплантационог имунитета; смањење броја Т-хелпера се јавља код хроничних бактеријских, вирусних, протозојских инфекција, туберкулозе, синдрома стечене имунодефицијенције, малигних тумора, опекотина, повреда, неухрањености, старења, лечења цитостатицима, излагања јонизујућем зрачењу.
  • Одређивање броја Т-супресора (анти-CD4 антитела). Нормално 17-37% или 300-700 ћелија/μl. Повећање броја Т-супресора се јавља у истим условима у којима се смањује број Т-помоћника, а њихово смањење се јавља у истим условима у којима се повећава садржај Т-помоћника.
  • Имунорегулаторни индекс CD4/CD8, нормално 1,5-2,5. Хиперактивност са вредностима преко 2,5 (алергијске и аутоимуне болести); хипоактивност - мање од 1,0 (предиспозиција ка хроничним инфекцијама). На почетку инфламаторног процеса, имунорегулаторни индекс се повећава, а када се смири, нормализује се.

Методе разјашњавања

• Одређивање броја природних убица (NK ћелија) - анти-CD16 и анти-CD56 антитела. Норма за CD 16 лимфоците је 6-26%, CD56 - 9-19%. Повећање броја NK ћелија се јавља током одбацивања трансплантата, смањење - код вирусних инфекција, рака, примарних и секундарних имунодефицијенција, опекотина, повреда и стреса, лечења цитостатицима и излагања јонизујућем зрачењу.
• Одређивање броја Т-лимфоцита са рецептором за интерлеукин-2 (маркер активације) - анти-CD25 антитела. Норма је 10-15%. Повећање њиховог броја се примећује код алергијских болести, одбацивања трансплантата, одговора на тимус-зависне антигене у акутном периоду примарне инфекције, смањење - код истих болести код којих долази до смањења броја NK ћелија.
• Проучавање експресије активационог маркера - молекула хистокомпатибилности класе II HLA-DR. Повећана експресија се јавља код инфламаторних процеса, код пацијената са хепатитисом Ц, целијакијом, сифилисом, акутним респираторним болестима.
• Процена апоптозе лимфоцита. Груба представа о спремности лимфоцита за апоптозу може се утврдити експресијом Fas рецептора (CD95) на њиховој површини и bd-2 прото-онкогена у митохондријама. Апоптоза лимфоцита се процењује третирањем са две флуоресцентне боје: пропидијум јодидом, који се везује за фрагменте ДНК, и анексином Y, који се везује за фосфатидилсерин, који се појављује на ћелијској мембрани на почетку апоптозе. Резултати се процењују помоћу проточног цитофлуометра. Резултати се израчунавају на основу односа ћелија обојених различитим бојама. Необојене ћелије су одрживе, ћелије везане само за анексин Y су ране манифестације апоптозе, при чему су пропидијум јодид и анексин Y касне манифестације апоптозе, бојење само пропидијум јодидом указује на некрозу.
• Евалуација пролиферације Т-лимфоцита in vitro.
  • Промене у ћелијској бластогенези - реакција бластне трансформације лимфоцита. Леукоцити се инкубирају са било којим митогеном биљног порекла (лектини). Фитохемаглутинин се најчешће користи 72 сата, затим се узима брис, боји и броји број бласта! Индекс стимулације је однос процента трансформисаних ћелија у експерименту (култура са фитохемаглутинином) према проценту трансформисаних ћелија у контроли (култура без фитохемаглутинина). Реакција бластне трансформације лимфоцита може се проценити укључивањем радиоактивне ознаке (ZN-тимндинум) у култивисане ћелије, пошто се синтеза ДНК повећава током ћелијске деобе. Поремећаји у пролиферативном одговору јављају се и код примарних и код секундарних имунодефицијенција повезаних са инфекцијама, раком, бубрежном инсуфицијенцијом и хируршким интервенцијама.
  • У овим студијама процењује се експресија активационих маркера (CD25, трансферински рецептор - CD71) и молекула главног комплекса хистокомпатибилности класе II HLA-DR, који практично нису присутни на Т-лимфоцитима у мировању. Т-лимфоцити се стимулишу фитохемаглутинином, након 3 дана експресија активационих маркера се анализира методом директне или индиректне имунофлуоресцентне реакције, проточне цитофлуорометрије, коришћењем моноклонских антитела на изоловане рецепторе.
  • Мерење количине медијатора које синтетишу активирани Т-лимфоцити [интерлеукин (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-интерферон, итд.] коришћењем радиоимунолошког теста или ELISA. Од посебног значаја је процена концентрације γ-интерферона и IL-4 као маркера Th1 и Th2 у супернатанту активираних култура и унутар ћелије. Ако је могуће, корисно је одредити експресију гена за одговарајући цитокин нивоом матриксне рибонуклеинске киселине у ћелији произвођачу и интензитетом експресије рецептора за одговарајуће цитокине.
    
• Реакција инхибиције миграције лимфоцита. Сензибилисани Т-лимфоцити у реакцији са антигеном луче лимфокине, укључујући факторе који инхибирају миграцију лимфоцита. Феномен инхибиције се примећује када се митогени унесу у ћелијску културу. Процена степена инхибиције нам омогућава да проценимо способност лимфоцита да луче цитокине. Нормално, учесталост миграције, у зависности од специфичног митогена, је 20-80%.
• Процена цитотоксичности NK ћелија. Одређује се способност природних ћелија убица да убију циљне ћелије еритромијелоидне линије K-562. Ако се процењује цитотоксичност зависна од антитела, користе се циљне ћелије обложене IgG антителима. Циљне ћелије се обележавају 3H-уридином и инкубирају са ефекторским ћелијама. Смрт циљних ћелија се процењује ослобађањем радиоактивне ознаке у раствор. Смањење цитотоксичности се јавља код малигних неоплазми. У неким случајевима, када је потребно предвидети ефикасност лечења интерлеукинима, цитотоксичност NK ћелија се процењује током инкубације са одређеним цитокинима.

Проучавање функције фагоцита

Методе скрининга

Проучавање интензитета апсорпције микробних ћелија фагоцитима (фагоцитоза латексних честица, тест култура стафилокока, Е. коли или микроорганизама изолованих од пацијента). Центрифугирањем хепаринизоване крви изолује се суспензија леукоцита, додаје се серум IV крвне групе ради опсонизације (опсонини су протеини који појачавају фагоцитозу). Микробна суспензија се разблажи, помеша са леукоцитима и инкубира 120 минута, узимајући узорке за анализу 30,90,120 минута након почетка инкубације. Из сакупљене суспензије леукоцита се праве брисеви. Одређују се следећи индикатори фагоцитозе:

• фагоцитни индекс - проценат ћелија које су ушле у фагоцитозу у року од 30 минута и 120 минута инкубације; стандардна вредност фагоцитног индекса (30) је 94%, фагоцитног индекса (120) је 92%;
• фагоцитни број - просечан број бактерија које се налазе интрацелуларно; стандардна вредност фагоцитног броја (30) је 11%, фагоцитни број (120) је 9,8%;
• коефицијент фагоцитног броја - однос фагоцитног броја (30) и фагоцитног броја (120); нормално 1,16;
• Бактерицидни индекс неутрофила - однос броја микроба убијених унутар фагоцита и укупног броја апсорбованих микроба; нормално 66%.

Методе разјашњавања

• Проучавање бактерицидне способности фагоцита у тесту са нитроплавим тетразолијумом (НБТ) - НБТ тест. Жута нитроплава тетразолијумска боја се додаје леукоцитима. Када неутрофил апсорбује боју, под утицајем слободних кисеоничних радикала долази до процеса редукције, што резултира плавом обојеношћу. Реакција се спроводи на плочи са равним дном са 96 бунарића. Ханксов раствор (спонтани НБТ) се додаје у прва три бунарића са смешом НБТ и леукоцита, а у други се додају честице латекса; смеша се инкубира на 37°C током 25 минута. Резултати се очитавају на 540 nm на читачу и изражавају у произвољним јединицама. Израчунава се коефицијент стимулације (K _st ), једнак односу оптичке густине у стимулисаним бунарићима и просечне оптичке густине у бунарићима без стимулације. Код здравих особа, НБТ _spont = 90 ± 45 CU, НБТ _stim = 140 ± 60 CU. К _ст = 1,78±0,36.
• Студија молекула адхезије. Проточна цитофлуорометрија се користи за одређивање експресије површинских антигена CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Имунодефицијенције са оштећеном адхезијом се манифестују рекурентним инфекцијама, спорим зарастањем рана и одсуством гноја у жариштима инфекције.

Проучавање система комплемента

Методе скрининга

Одређивање хемолитичке активности комплемента је проучавање класичног пута активације комплемента. Различита разблажења серума болесне и здраве особе додају се овчијим еритроцитима обложеним антителима. Јединица хемолитичке активности је реципрочна вредност разблажења серума при којем је уништено 50% еритроцита. Степен хемолизе се процењује фотометријски ослобађањем хемоглобина у раствор. Смањење хемолитичке активности комплемента примећује се код системског еритематозног лупуса са оштећењем бубрега, акутног гломерулонефритиса, комбинованих имунодефицијенција, мијастеније, вирусног хепатитиса, лимфома, а повећање - код опструктивне жутице, Хашимотовог тиреоидитиса, реуматизма, реуматоидног артритиса, нодуларног периартеритиса, дерматомиозитиса, инфаркта миокарда, улцерозног колитиса, Рајтеровог синдрома, гихта.

Методе разјашњавања

• Одређивање компоненти комплемента. Квантитативно одређивање се врши радијалном имунодифузијом и нефелометријом.
  Студија није информативна уколико се антигена својства компоненти комплемента не промене.
• Утврђено је да Clq компонента комплемента појачава фагоцитозу и посредује у ћелијској цитотоксичности. Њено смањење се јавља код имунокомплексних болести, системског еритематозног лупуса, гнојних инфекција и тумора.
• C3 компонента је укључена у активацију класичних и алтернативних путева комплемента. Смањење њене концентрације повезано је са хроничним бактеријским и гљивичним инфекцијама, присуством циркулишућих или ткивних имуних комплекса.
• Компонента C4 је укључена у активацију класичног пута. Смањење њене концентрације повезано је са продуженом активацијом комплемента имуним комплексима и смањењем концентрације инхибитора C1, који контролише активацију класичног пута комплемента. Недостатак C4 се јавља код системског еритематозног лупуса, повећање C4 се јавља код болести бубрега, одбацивања трансплантата, акутне упале и гастроинтестиналних болести.
• C5a је мали фрагмент молекула C5, који се од њега одваја као резултат активације система комплемента. Његова концентрација се повећава током упале, сепсе, атопијских и алергијских болести.
• Cl-инхибитор је мултифункционални фактор. Контролише активацију компоненте комплемента C1, инхибира активност каликреина, плазмина и активираног Хагемановог фактора, Cl8 и Or протеаза. Недостатак C1-инхибитора доводи до ангиоедема.
• функционалне студије комплемента. Тестирани серум се додаје стандардном серуму коме недостаје било која компонента комплемента и одређује се хемолитичка активност комплемента. Ако се хемолитичка активност не врати у нормалу, активност ове компоненте комплемента у тестном серуму се сматра смањеном.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]