Лабораторијска дијагноза остеоартритиса

У већини случајева, пацијенти са остеоартритисом немају промене у анализама крви и урина, осим у случајевима синовитиса са значајним изливом, када се може јавити повећање седиментације еритроцита (СЕ), хипергамаглобулинемија, повећање нивоа индикатора акутне фазе - ЦРП, фибриногена итд. Приликом испитивања синовијалне течности, не откривају се значајне разлике од нормалних показатеља.

Последњих година се интензивно трага за могућим биолошким маркерима (БМ) деградације и репарације зглобних ткива (углавном хрскавице и костију). БМ треба да одражава ове динамичке промене, да служи као предиктор прогнозе остеоартрозе и маркери ефикасности патогенетског лечења. Откриће нових и детаљније проучавање познатих биолошких маркера омогућиће боље разумевање механизама патогенезе остеоартрозе. Међутим, главни задатак коришћења биолошких маркера метаболизма хрскавице је процена хондропротективних својстава лекова и праћење лечења лековима који припадају DMO AD групи - „модификујући болест“.

Код остеоартритиса, патолошке промене се јављају углавном у зглобној хрскавици, као и у субхондралној кости, синовијалној мембрани и другим меким ткивима зглоба. Пошто је наша могућност директног испитивања ових структура ограничена, најважнији извори за прикупљање биолошких маркера су крв, урин и синовијална течност.

Тестирање урина је најпожељније, јер не укључује никакве инвазивне процедуре. По нашем мишљењу, идеалан материјал за тестирање је дневни урин. Анализа јутарњег урина би била прикладнија, али могућност његове употребе заснива се само на чињеници да се ова врста анализе користи за одређивање биолошких маркера метаболизма костију код остеопорозе: познато је да су биолошки маркери подложни циркадијалним ритмовима, а врхунац концентрације биолошких маркера метаболизма костију јавља се ноћу. Тренутно у литератури нема информација о циркадијалним ритмовима биолошких маркера меких ткива, хрскавице, тако да ће коначна одлука о избору адекватног теста урина бити донета након спровођења одговарајућих студија.

Крвне анализе су рутинске клиничке провере. Неки биолошки маркери се већ одређују у крви, као што су индекси акутне фазе, док би други могли бити укључени у стандардну листу биохемијских тестова у блиској будућности. За сваки биолошки маркер потребно је навести у којој компоненти крви треба да се одређује - плазми или серуму. Резултати истраживања указују да се концентрација биолошких маркера у крвној плазми значајно разликује од оне у серуму. Биолошки маркери се обично одређују у крвном серуму. Према В. Рајану и др. (1998), концентрације биолошких маркера у крви узетој из вене близу захваћеног зглоба и из удаљеније вене су различите. Ови подаци указују на потребу стандардизације узорковања крви за проучавање биолошких маркера.

Према LJ Attencia et al. (1989), хрскавица синовијалних зглобова одрасле особе чини само 10% укупне масе хијалинске хрскавице у телу, укључујући интервертебралне дискове. Дакле, одређивање биолошких маркера у крви и урину одражава системски метаболизам, а не локалне промене у зглобу погођеном остеоартрозом. Синовијална течност је најближа патолошком фокусу код остеоартрозе и вероватно најтачније одражава процесе који се одвијају у погођеном зглобу. Концентрација биолошких маркера у синовијалној течности може бити знатно већа него у крви, што значи да ју је лакше одредити. Примери укључују епитоп 846 агрекана - у синовијалној течности га је 40 пута више него у крвном серуму, протеине олигомерне матрице хрскавице (COMP) - 10 пута више него у крвном серуму. Продукти разградње у синовијалној течности тачније одражавају катаболичке процесе у зглобној хрскавици. Дренажа молекула из синовијалне течности кроз локални лимфни систем може довести до смањења њихове величине, па чак и до њиховог уништења.

Упркос инвазивности технике сакупљања синовијалне течности, повезане са бројним могућим компликацијама, вредност одређивања биолошких маркера у њој је очигледна. Да би се избегли проблеми са такозваним сувим зглобом, 20 мл изотоничног раствора NaCl може се убризгати у зглоб непосредно пре сакупљања течности. Одмах након убризгавања изотоничног раствора, пацијент треба да савије и испружи уд у зглобу 10 пута, након чега следи брза аспирација разблажене синовијалне течности. Према ЕМ-ЈА Тонару (2000), такво разблаживање синовијалне течности утиче на метаболизам у зглобној хрскавици. Међутим, резултати студије ФЦ Робиона и др. (2001) указују на то да поновљено испирање колених зглобова коња не изазива значајне промене у метаболизму хрскавице. Ови подаци свакако захтевају потврду. Стога, за сваки биолошки маркер, ефекат испирања зглоба на промене његове концентрације мора се утврдити у фази преклиничких студија на животињама.

Следећа важна тачка је одређивање времена полураспада у синовијалној течности и крви за сваки биолошки маркер. Без таквих података, тумачење резултата теста биће тешко. Обично је време полураспада биолошки активних супстанци у крви краће него у другим течним медијумима због ефикасног клиренса путем јетре и бубрега. Стога је за сваки биолошки маркер потребно одредити и пут елиминације. Тако се N-пропептид колагена типа III излучује из јетре путем рецепторски посредоване ендоцитозе, а негликозиловани фрагменти колагена се излучују углавном урином, као и остеокалцин. Постоје рецептори за гликозаминогликане на ендотелним ћелијама синуса лобула јетре, тако да се хијалуронска киселина и протеогликани елиминишу путем јетре. Време полураспада хијалуронске киселине у крви је 2-5 минута. Присуство синовитиса може убрзати клиренс биолошких маркера из зглобова, иако студија на зечевима није пронашла значајне разлике у клиренсу протеогликана са или без синовитиса. Стога је потребно истражити утицај упале на промене концентрације биолошких маркера у телесним течностима.

Бубрези селективно филтрирају биолошке маркере. Стога, гликозаминогликани, који носе велико негативно наелектрисање, можда неће продрети у бубрежну базалну мембрану, док се гликозаминогликани попут хондроитин-6-сулфата и хондроитин-4-сулфата детектују у урину.

Поред патологије (посебно остеоартритиса), низ фактора може утицати на концентрацију биолошких маркера у телесним течностима:

1. Циркадијални ритмови су проучавани само за мали број биолошких маркера. Проучавани су за маркере метаболизма костију. Тако се врхунац концентрације остеокалцина јавља ноћу, а унакрсних веза колагена ујутру - у 8 сати. Код реуматоидног артритиса, врхунац активности IL-6 се такође јавља ноћу (око 2 сата), и то раније него код остеокалцина. Ови подаци су од извесног интереса у вези са учешћем IL-6 у упали и физиологији коштаног ткива. TNF-α, напротив, нема циркадијалне ритмове. Међутим, рецептори овог цитокина могу им се покоравати.
2. Перисталтика. Хијалуронску киселину синтетишу синовијалне ћелије (као и многе друге ћелије) и потенцијални је маркер синовитиса код остеоартритиса и реуматоидног артритиса. Међутим, највећа концентрација хијалуроната налази се у цревном лимфном систему. Није изненађујуће да се концентрација хијалуронске киселине у циркулацији може повећати након јела. Стога, узимање узорака крви за одређивање биолошких маркера треба обавити на празан стомак или 3 сата након јела. А ефекат перисталтике на ниво биолошких маркера у крви захтева проучавање.
3. Физичка активност ујутру након спавања доводи до повећања концентрације хијалуронске киселине у крви, ММП-3 и епитопа кератан сулфата код здравих особа. Физичка активност може променити концентрацију неких маркера и у синовијалној течности и у крвном серуму. Такво повећање је израженије код пацијената са реуматоидним артритисом, штавише, концентрација биолошких маркера корелира са клиничким стањем ових пацијената.
4. Болести јетре и бубрега. Цироза јетре узрокује значајно повећање нивоа хијалуронске киселине у серуму и вероватно утиче на елиминацију протеогликана. Познато је да болести бубрега утичу на концентрације остеокалцина. Ово питање такође захтева детаљније проучавање.
5. Старост и пол. Током раста, активност ћелија плоче раста се повећава, што је праћено повећањем концентрације скелетних биолошких маркера у крвном серуму. Пример је повећање концентрације агреканских фрагмената и колагена типа II у периферној крви и урину животиња у расту. Стога је тумачење анализа биолошких маркера код деце и адолесцената са мишићно-скелетним болестима тешко. За многе биолошке маркере утврђено је повећање концентрације са старењем. Код мушкараца, концентрација биолошких маркера значајно премашује ону код жена у хрскавичном и коштаном ткиву. Поред тога, код жена у менопаузалном и постменопаузалном периоду могу се очекивати промене у концентрацији биолошких маркера метаболизма хрскавице, слично онима које се примећују у коштаном ткиву.
6. Хируршке процедуре такође могу утицати на нивое биолошких маркера, а овај ефекат може трајати неколико недеља.

Концепт биолошких маркера остеоартрозе заснива се на претпоставци да они одражавају одређене аспекте метаболичких процеса у зглобним ткивима. Међутим, однос између концентрација биолошких маркера у телесним течностима и метаболизма хрскавице, синовијалног и других ткива показао се веома сложеним.

На пример, концентрација маркера деградације ECM зглобне хрскавице у синовијалној течности може зависити не само од степена деградације самог матрикса, већ и од других фактора, као што је степен елиминације молекуларних фрагмената из синовијалне мембране, што је већ горе поменуто, као и од количине хрскавичног ткива које је преостало у зглобу.

Упркос горе наведеним чињеницама, концентрација биолошких маркера у синовијалној течности генерално корелира са метаболизмом молекула ECM зглобне хрскавице. На пример, промене у концентрацији фрагмената агрекана, епитопа 846, COMB и C-пропептида колагена II у синовијалној течности након повреде зглоба и током развоја остеоартрозе су у складу са променама у интензитету метаболизма агрекана, COMB и колагена II у експерименталним моделима остеоартрозе код животиња/и in vivo и у зглобној хрскавици пацијената са остеоартрозом/и in vitro.

Идентификација специфичних извора молекуларних фрагмената је сложен процес. Повећано ослобађање молекуларних фрагмената може се десити како због општег повећања процеса разградње који нису компензовани синтетичким процесима, тако и због повећане разградње уз истовремени пораст интензитета синтезе истих молекула ECM; у овом другом случају, концентрација молекула ECM се не мења. Стога је потребно тражити маркере специфичне за разградњу и синтезу. Пример првог су фрагменти агрекана, а другог је C-пропептид колагена 11.

Чак и ако је биолошки маркер повезан са специфичним аспектом метаболизма, неопходно је узети у обзир специфичне карактеристике овог процеса. На пример, идентификовани фрагменти могу настати као резултат деградације de novo синтетисаног молекула који се још није интегрисао у функционални ECM, молекула који је тек интегрисан у ECM, и коначно трајног ECM молекула који је важан функционални део зреле матрице. Још један проблем је дефиниција специфичне зоне матрикса (перицелуларне, територијалне и интертериторијалне матрице) која је служила као извор биолошких маркера детектованих у синовијалној течности, крви или урину. Студије in vitro указују да интензитет метаболизма у појединачним зонама ECM зглобне хрскавице може бити различит. Проучавање одређених епитопа повезаних са хондроитин сулфат сулфацијом може помоћи у идентификацији популације de novo синтетисаних молекула агрекана.

Може се претпоставити да је појава фрагмената молекула који су нормално присутни у хрскавичном ECM-у у синовијалној течности повезана са метаболизмом хрскавичног матрикса. Међутим, то није увек случај, јер зависи од низа фактора, посебно од тога колико концентрација датог молекула у зглобној хрскавици премашује ону у другим зглобним ткивима и колико интензитет његовог метаболизма у хрскавици премашује онај у другим зглобним ткивима. Дакле, укупна маса агрекана у зглобној хрскавици значајно премашује ону, на пример, у менискусу коленског зглоба, док се укупна маса COMB-а у менискусу практично не разликује од оне у зглобној хрскавици. И хондроцити и синовоцити производе стромелизин-1, али укупан број ћелија у синовијалној мембрани премашује онај у хрскавици, тако да је значајан део стромелизина-1 који се налази у синовијалној течности највероватније синовијалног порекла. Стога је идентификација специфичног извора биолошких маркера изузетно тешка и често немогућа.

Приликом проучавања биолошких маркера у крвном серуму и урину, јавља се проблем одређивања његовог могућег екстраартикуларног извора. Поред тога, у случају моноартикуларног оштећења, биолошки маркери које лучи захваћени зглоб могу се мешати са маркерима које луче нетакнути зглобови, укључујући и контралатералне. Зглобна хрскавица чини мање од 10% укупне масе хијалинске хрскавице у телу. Стога, одређивање биолошких маркера у крви и урину може бити оправдано пре код полиартикуларних, или системских, болести (у вези са остеоартрозом - код генерализоване остеоартрозе).

Захтеви за биолошке маркере зависе од тога да ли се користе као дијагностички, прогностички или евалуативни тест. На пример, дијагностички тест одређује разлике између здравих особа и пацијената са остеоартритисом, што се изражава у смислу осетљивости и специфичности теста. Прогностички тест идентификује појединце у кохорти који највероватније брзо напредују код болести. Коначно, евалуативни тест се заснива на способности маркера да прати промене током времена код појединачног пацијента. Поред тога, биолошки маркери се могу користити за одређивање осетљивости пацијената на одређени лек.

У почетку се претпостављало да биолошки маркери могу послужити као дијагностички тестови који би помогли у разликовању зглоба захваћеног остеоартрозом од интактног, као и у спровођењу диференцијалне дијагностике са другим болестима зглобова. Стога је одређивање концентрације кератан сулфата у крвном серуму сматрано дијагностичким тестом за генерализовану остеоартрозу. Међутим, накнадне студије су показале да овај биолошки маркер може само у неким ситуацијама одражавати разградњу хрскавичних протеогликана. Испоставило се да концентрације биолошких маркера у крвном серуму зависе од старости и пола особе која се испитује.

Претпостављени биолошки маркери метаболизма зглобног ткива у синовијалној течности и крвном серуму пацијената са остеоартритисом

Биолошки маркер	Процес	У синовијалној течности (линкови)	У крвном серуму (линкови)
1. Хрскавица
Агрекан
Фрагменти основних протеина	Деградација агрекана	Ломандер Л.С. и др., 1989; 1993	Тхонар ЕЈМА ет ал., 1985; Цампион ГВ ет ал., 1989; МехрабанФ. ет ал., 1991; Спецтор ТД ет ал., 1992; Лохмандер ЛС., Тхонар ЕЈ-МА, 1994; Пооле АР ет ал., 1994) т (Пооле АР ет ал., 1994)
Епитопи основних протеина (специфични неоепитопи зоне цепања)	Деградација агрекана	Санди ЈД ет ал., 1992; ЛохмандерЛС. ет ал., 1993; ЛаркМ.В. ет ал., 1997
Епитопи кератонских сулфата	Деградација агрекана	Кампион Г.В. и др., 1989; Белчер Ц. и др., 1997
Епитопи хондроитин сулфата (846, ЗВЗ, 7D4 и DR.)	Синтеза/разградња агрекана	Пооле АР ет ал., 1994; ХазеллП.К. ет ал., 1995; Слатер РР Јр. ет ал., 1995; Плаас АХК ет ал., 1997; 1998; Лохмандер ЛС. ет ал., 1998
Однос хондроитин-6 и хондроитин-4 сулфата	Синтеза/разградња агрекана	Шинме иМ. и др. 1993.
Мали протеогликани	Разградња малих протеогликана	Вич-ПремП. и др., 1992
Матриксни протеини хрскавице
ХОМП	Деградација HOMP-а	Сакне Т., Хеинегерд Д., 1992"; ЛохмандерЛС. ет ал., 1994; Петерссон ИФ ет ал., 1997	Шариф М. и др., 1995
Колагени хрскавице
Ц-пропептид колагена типа II	Синтеза колагена II	СхинмеиМ. ет ал., 1993; ИосхихараИ. ет ал., 1995; ЛохмандерЛС. ет ал., 1996
Фрагменти алфа ланца колагена типа II	Разградња колагена II	Холландер АП ет ал., 1994; Биллингхурст РЦ ет ал., 1997; АтлеиЛМ. ет ал., 1998
ММП и њихови инхибитори	Синтеза и секреција	Из синовијалне или зглобне хрскавице?
II. Менискус
ХОМП	Деградација HOMP-а	Од зглобне хрскавице, менискуса или синовијалне мембране?
Мали протеогликани	Разградња малих протеогликана
III. Синовијална мембрана
Хијалуронска киселина	Синтеза хијалуронске киселине		Голдберг Р.Л. и др., 1991; ХединП.-Ј. и др., 1991; Шариф М. и др., 1995
ММП и њихови инхибитори
Стромелизин (ММП-3)	Синтеза и секреција ММП-3	ЛохманерЛС и др., 1993	ЗуцкерС. ет ал., 1994; ИосхихараИ. ет ал., 1995
Интерстицијална колагеназа (MMP-1)	Синтеза и секреција ММП-1	Кларк ИМ и др., 1993; ЛомандерЛС и др., 1993	Маникур ДХ и др., 1994
ТИМП	Синтеза и секреција ТИМП-а	Лохмандер ЛС. ет ал., 1993; Маницоурт ДХ ет ал., 1994	Иосхихара И. ет ал., 1995
Н-пропептид колагена типа III	Синтеза/разградња колагена III	Шариф М. и др., 1996	Шариф М. и др., 1996

Бројне студије су показале разлике у концентрацијама агреканских фрагмената, HOMP и MMP и њихових инхибитора у зглобној течности коленских зглобова здравих добровољаца, пацијената са реуматоидним артритисом, реактивним артритисом или остеоартрозом. Упркос чињеници да аутори показују значајне разлике у просечним концентрацијама биолошких маркера, интерпретација података је тешка, јер је упоредна анализа била профилна и ретроспективна. Прогностичка својства ових тестова потребно је потврдити у проспективним студијама.

Биолошки маркери могу се користити за процену тежине болести или стадијума патолошког процеса. У случају остеоартрозе, тежина болести и њени стадијуми се процењују на основу резултата рендгенских прегледа, артроскопије, као и на основу тежине синдрома бола, ограничења функције захваћених зглобова и функционалног капацитета пацијента. Л. Далберг и др. (1992) и Т. Саксне и Д. Хајнегард (1992) предложили су коришћење неких молекуларних маркера метаболизма зглобне хрскавице за додатну карактеризацију стадијума остеоартрозе. Међутим, неопходна су даља истраживања у овом правцу како би се такви биолошки маркери увели у медицинску праксу.

Постоје извештаји о могућој употреби биолошких маркера као прогностичких тестова. На пример, показано је да концентрација хијалуронске киселине (али не и кератан сулфата) у серуму пацијената са остеоартритисом колена на почетку студије указује на прогресију гонартрозе током 5 година посматрања. У истој популацији пацијената, показано је да је повећан садржај COMB-а у серуму пацијената са гонартрозом током прве године након почетка студије повезан са радиографском прогресијом током 5 година посматрања. Студије биолошких маркера код пацијената са реуматоидним артритисом показале су да је концентрација COMB-а, епитопа 846, хондроитин сулфата у серуму повезана са бржом прогресијом болести. Ови резултати, добијени у малим групама пацијената, често не показују јачину везе између нивоа биолошких маркера и прогресије болести, тј. потребна су даља истраживања, проспективна и на већим кохортама пацијената.

Т. Д. Спектор и др. (1997) су пронашли благо повећање серумског ЦРП-а код пацијената са раним остеоартритисом и известили да ЦРП може бити предиктор прогресије остеоартритиса. У овом случају, повећање ЦРП-а одражава процесе оштећења зглобног ткива и може бити повезано са повећањем хијалуронске киселине, што такође указује на прогресију болести. Могуће је да је синовијална мембрана одговорна за већину хијалуронске киселине одређене у серуму, што указује на присуство благог синовитиса. Повећане концентрације стромелизина ММП у синовијалној течности и серуму пацијената са остеоартритисом и након повреде зглоба такође могу бити повезане са благим синовитисом.

Коначно, биолошки маркери могу се користити као критеријуми ефикасности у клиничким испитивањима лекова, као и за праћење патогенетског лечења. Међутим, постоје два међусобно повезана проблема: недостатак лекова са доказаним својствима која „модификују структуру“ или „модификују болест“ у великој мери је последица недостатка поузданих биолошких маркера, и обрнуто, недостатак специфичних маркера метаболизма зглобног ткива у великој мери је последица недостатка контролисаних студија лекова у овим групама.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]