Једна бочица, две мете: Преносива дијагноза туберкулозе заснована на CRISPR-у са 100% осетљивошћу

Рад о преносивом тесту за туберкулозу који се може урадити директно из спутума, без сложене опреме, објављен је у часопису Science Advances. Изотермна амплификација ДНК и CRISPR очитавање су комбиновани у једној епрувети; две конзервативне инсерције M. tuberculosis (IS6110 и IS1081) се тестирају истовремено, плус људски ген као интерна контрола узорка. У малом „слепом“ тесту на клиничким узорцима, тест је дао 100% осетљивост (6/6) и 100% специфичност (7/7) у поређењу са културом; граница детекције је ~69–81 CFU/ml у симулираном спутуму. Резултат се може видети на папирној тест траци, а реагенси су лиофилизовани (складиштење без „хладног ланца“).

Позадина

Према СЗО, туберкулоза ће убити око 1,25 милиона људи 2023. године; туберкулоза је поново постала водећи заразни узрок смрти, са процењених 10,8 милиона случајева. Због тога је приступачна и брза дијагностика кључна, посебно у условима ограничених ресурса.

• Тренутни тестови представљају компромис између тачности, брзине и цене. „Златни стандард“ култура је веома прецизан, али спор; микроскопија је брза, али неосетљива; PCR платформе попут Xpert MTB/RIF Ultra су знатно осетљивије (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), али захтевају скупу опрему и кертриџе, што ограничава покривеност.
• Зашто изотермно и CRISPR. Изотермна RPA амплификација ради на 37–42 °C и не захтева термоциклере — погодно „на терену“. CRISPR очитавање (Cas12/13) додаје специфичност врсте и омогућава визуелни латерални ток („трака“) без сложене оптике. Све у свему, ово је пут ка преносивим и јефтиним PVR тестовима.
• Зашто две МБТ мете одједном (IS6110 + IS1081). IS6110 је вишекопијски уметак комплекса M. tuberculosis, али неке линије имају мало копија, и тестови само за IS6110 могу „промашити“. Додавање другог уметка IS1081 смањује ризик од лажно негативних резултата.
• Зашто интерна људска контрола. Узорци даха могу да садрже инхибиторе и „лоше“ узорке. Ендогена људска контрола (нпр. РНаза П/геномска ДНК) потврђује да је материјал адекватан и да реакција није потиснута - у супротном резултат се не може сматрати негативним.
• Формат са једним судом је сам по себи важан. Смањује број корака, смањује ризик од контаминације и олакшава рад ван лабораторије. Такви приступи за туберкулозу су већ показали одрживост; нови рад проширује идеју на формат са два циља са интерним контролама, плус демонстрира лиофилизацију реагенса и читач трака.
• Која је вредност овог чланка? Аутори су демонстрирали детекцију директно из спутума након најједноставније припреме узорка, границу детекције од ~70–80 CFU/ml у симулираном спутуму и 100% осетљивост/специфичност на малом слепом скупу клиничких узорака — добра „технолошка демонстрација“ за даље мултицентричне валидације.

Како ово функционише

• Научници су комбиновали RPA (брзу изотермну амплификацију генетског материјала на 37 °C) са ензимима за „сечење“ Cas13a/Cas12a. Након што су одабрали водеће РНК, конфигурисали су систем да циља две MBT мете истовремено, и паралелно са људском ДНК (проверавајући да ли уопште постоји материјал у узорку и да ли је реакција „застала“).
• Сва хемија иде у једну епрувету; након инкубације, резултат се очитава или флуориметром или на латералној проточној траци - у суштини као експресни тест.
• Обрада спутума је поједностављена на загревање и кратко центрифугирање - без екстрактора нуклеинских киселина. За најрестриктивније услове, аутори чак разматрају ручне алтернативе центрифуги.

Шта су тестови показали

• Граница детекције: 69,0 CFU/ml (сој H37Rv) и 80,5 CFU/ml (BCG) у „шиљастом“ спутуму. Није откривена унакрсна реактивност са другим бактеријама/гљивицама.
• Клиничко окружење (слепи узорци): на 13 узорака из стварне праксе - 100% осетљивост (6/6) и 100% специфичност (7/7) у односу на засејавање. Поређења ради, на истом комплету GeneXpert Ultra је показао 100%/86%, респективно.
• Техничке нијансе: од две опције очитавања, Cas13a је боље функционисао (за формат „једног лонца“, осетљивији је од Cas12a). Поред тога, паралелно тестирање две Mtb мете смањује ризик од лажних резултата.

Зашто је ово неопходно?

Данашњи тестови су компромис између тачности, брзине и доступности: култура је веома прецизна, али спора; брисеви су брзи, али нетачни; PCR системи попут GeneXpert-а су прецизни и брзи, али захтевају скупе инструменте и кертриџе. Нови CRISPR приступ има за циљ да премости ту празнину: теренска дијагностика која ради на 37°C, са очитавањима папирних трака и могућношћу складиштења реагенса без хлађења.

Ограничења и шта је следеће

Ово је рана демонстрација на малом клиничком скупу - потребни су велики, мултицентрични тестови (укључујући коинфекцију ХИВ-ом, код деце, са пауцибациларним облицима и различитим МБТ линијама). Аутори посебно напомињу да ће у самој „теренској“ верзији, стона центрифуга морати бити замењена потпуно ручним решењем. Али сама архитектура - „две мете + интерна контрола“ у једној епрувети - већ је доказала своју оперативност и пружа јасан пут ка усавршавању за масовну употребу.

Извор: Александра Г. Бел и др. Поједностављени тест заснован на CRISPR-у за детекцију туберкулозе директно из спутума, Science Advances, онлајн 6. августа 2025. (том 11, број 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206