Вештачки срчани залисци

Савремени биолошки вештачки срчани залисци доступни за клиничку употребу, са изузетком плућног аутографта, су неодрживе структуре које немају потенцијал за раст и репарацију ткива. То намеће значајна ограничења на њихову употребу, посебно код деце, за корекцију патологије залистака. Инжењерство ткива се развило током последњих 15 година. Циљ овог научног правца је стварање у вештачким условима структура као што су вештачки срчани залисци са тромборезистентном површином и одрживим интерстицијумом.

[ 1 ], [ 2 ]

Како се развијају вештачки срчани залисци?

Научни концепт ткивног инжењерства заснива се на идеји насељавања и узгоја живих ћелија (фибробласта, матичних ћелија итд.) у синтетичком или природном апсорбујућем скелу (матриксу), који представља тродимензионалну структуру вентила, као и на коришћењу сигнала који регулишу експресију гена, организацију и продуктивност трансплантираних ћелија током периода формирања екстрацелуларног матрикса.

Такви вештачки срчани залисци се интегришу са ткивом пацијента ради коначне рестаурације и даљег одржавања њихове структуре и функције. У овом случају, нови колаген-еластински оквир или, прецизније, екстрацелуларни матрикс се формира на оригиналном матриксу као резултат функционисања ћелија (фибробласта, миофибробласта итд.). Као резултат тога, оптимални вештачки срчани залисци створени ткивним инжењерством требало би да буду блиски изворним у погледу анатомске структуре и функције, а такође да имају биомеханичку прилагодљивост, способност репарације и раста.

Инжењеринг ткива развија вештачке срчане залиске користећи различите изворе сакупљања ћелија. Стога се могу користити ксеногене или алогене ћелије, иако су прве повезане са ризиком од преношења зооноза на људе. Могуће је смањити антигеност и спречити реакције одбацивања организма генетском модификацијом алогених ћелија. Инжењеринг ткива захтева поуздан извор ћелија. Такав извор су аутогене ћелије узете директно од пацијента и не производе имуне реакције током реимплантације. Ефикасни вештачки срчани залисци се производе на основу аутологних ћелија добијених из крвних судова (артерија и вена). Развијена је метода заснована на употреби флуоресцентно активираног сортирања ћелија - FACS за добијање чистих ћелијских култура. Мешовита ћелијска популација добијена из крвног суда обележена је ацетилованим маркером липопротеина ниске густине, који се селективно апсорбује на површини ендотелиоцита. Ендотелне ћелије се затим могу лако одвојити од већине ћелија добијених из крвних судова, које ће бити мешавина ћелија глатких мишића, миофибробласта и фибробласта. Извор ћелија, било да је у питању артерија или вена, утицаће на својства коначне конструкције. Стога, вештачки срчани залисци са матрицом засејаном венским ћелијама су супериорнији у формирању колагена и механичкој стабилности у односу на конструкције засејане артеријским ћелијама. Избор периферних вена изгледа као погоднији извор сакупљања ћелија.

Миофибробласти се такође могу узети из каротидних артерија. Међутим, ћелије изведене из крвних судова имају значајно другачије карактеристике од природних интерстицијалних ћелија. Аутологне ћелије пупчане врпце могу се користити као алтернативни извор ћелија.

Вештачки срчани залисци засновани на матичним ћелијама

Последњих година, напредак у инжењерству ткива је олакшан истраживањем матичних ћелија. Употреба матичних ћелија црвене коштане сржи има своје предности. Посебно, једноставност сакупљања биоматеријала и ин витро култивације са накнадном диференцијацијом у различите типове мезенхималних ћелија омогућава избегавање употребе интактних крвних судова. Матичне ћелије су плурипотентни извори ћелијских лоза и имају јединствене имунолошке карактеристике које доприносе њиховој стабилности у алогеним условима.

Матичне ћелије црвене коштане сржи човека добијају се стерналном пункцијом или пункцијом илијачног гребена. Изолују се из 10-15 мл аспирата грудне кости, одвајају од осталих ћелија и култивишу. Након достизања потребног броја ћелија (обично у року од 21-28 дана), засејавају се (колонизирају) на матрице и култивишу у хранљивој подлози у статичном положају (7 дана у влажном инкубатору на 37 °C у присуству 5% CO2). Након тога, раст ћелија се стимулише кроз каптурални медијум (биолошки стимулуси) или стварањем физиолошких услова за раст ткива током његове изометријске деформације у репродукционом апарату са пулсирајућим протоком - биореактору (механички стимулуси). Фибробласти су осетљиви на механичке стимулусе који подстичу њихов раст и функционалну активност. Пулсирајући проток изазива повећање и радијалних и циркумферентних деформација, што доводи до оријентације (издужења) насељених ћелија у правцу таквих напрезања. То, заузврат, доводи до формирања оријентисаних влакнастих структура залистака. Константан проток изазива само тангенцијална напрезања на зидовима. Пулсирајући ток има благотворно дејство на ћелијску морфологију, пролиферацију и састав екстрацелуларног матрикса. Природа тока хранљиве средине, физичко-хемијски услови (pH, pO2 и pCO2) у биореактору такође значајно утичу на производњу колагена. Дакле, ламинарни ток, цикличне вртложне струје повећавају производњу колагена, што доводи до побољшаних механичких својстава.

Други приступ узгоју ткивних структура је стварање ембрионалних услова у биореактору уместо симулације физиолошких услова људског тела. Ткивни биовлапци узгајани на бази матичних ћелија имају мобилне и флексибилне режњеве, функционално способне под утицајем високог притиска и протока који прелази физиолошки ниво. Хистолошке и хистохемијске студије режњева ових структура показале су присуство активних процеса биодеструкције матрикса и његове замене одрживим ткивом. Ткиво је организовано према слојевитом типу са карактеристикама екстрацелуларних матричних протеина сличних онима код природног ткива, присуством колагена типа I и III и гликозаминогликана. Међутим, типична трослојна структура режњева - вентрикуларни, сунђерасти и фиброзни слојеви - није добијена. ASMA-позитивне ћелије које експресују виментин, пронађене у свим фрагментима, имале су карактеристике сличне онима миофибробласта. Електронска микроскопија је открила ћелијске елементе са карактеристикама карактеристичним за одрживе, секреторно активне миофибробласте (актински/миозински филаменти, колагенске нити, еластин) и ендотелне ћелије на површини ткива.

Колаген типова I, III, ASMA и виментин су детектовани на листићима. Механичка својства листића ткива и природних структура била су упоредива. Ткивни вештачки срчани залисци показали су одличне перформансе током 20 недеља и подсећали су на природне анатомске структуре по својој микроструктури, биохемијском профилу и формирању протеинске матрице.

Сви вештачки срчани залисци добијени ткивним инжењерингом имплантирани су животињама у плућном положају, јер њихове механичке карактеристике не одговарају оптерећењима у аортном положају. Ткивни залисци експлантирани из животиња су по структури блиски нативним, што указује на њихов даљи развој и реструктурирање in vivo. Даља истраживања ће показати да ли ће се процес реструктурирања и сазревања ткива наставити под физиолошким условима након имплантације вештачких срчаних залистака, као што је примећено у експериментима на животињама.

Идеални вештачки срчани залисци треба да имају порозност од најмање 90%, јер је то неопходно за раст ћелија, испоруку хранљивих материја и уклањање ћелијских метаболичких производа. Поред биокомпатибилности и биоразградивости, вештачки срчани залисци треба да имају хемијски повољну површину за засејавање ћелија и да одговарају механичким својствима природног ткива. Ниво биоразградње матрикса треба да буде контролисан и пропорционалан нивоу формирања новог ткива како би се осигурала механичка стабилност током времена.

Тренутно се развијају синтетичке и биолошке матрице. Најчешћи биолошки материјали за креирање матрица су донорске анатомске структуре, колаген и фибрин. Полимерни вештачки срчани залисци се дизајнирају тако да се биоразграде након имплантације, када имплантиране ћелије почну да производе и организују сопствену мрежу екстрацелуларног матрикса. Формирање новог матриксног ткива може бити регулисано или стимулисано факторима раста, цитокинима или хормонима.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Донорски вештачки срчани залисци

Донорски вештачки срчани залисци добијени од људи или животиња и осиромашени ћелијским антигенима децелуларизацијом ради смањења њихове имуногености могу се користити као матрице. Конзервирани протеини екстрацелуларне матрице су основа за накнадну адхезију засејаних ћелија. Постоје следеће методе уклањања ћелијских елемената (ацелуларизација): замрзавање, третман трипсином/ЕДТА, детерџенти - натријум додецил сулфат, натријум деоксиколат, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, као и вишестепене ензимске методе третмана. У овом случају, ћелијске мембране, нуклеинске киселине, липиди, цитоплазматске структуре и растворљиви молекули матрикса се уклањају уз очување колагена и еластина. Међутим, идеална метода још увек није пронађена. Само натријум додецил сулфат (0,03-1%) или натријум деоксиколат (0,5-2%) резултирали су потпуним уклањањем ћелија након 24 сата третмана.

Хистолошки преглед уклоњених децелуларизованих биовластика (алографта и ксенографта) у експерименту на животињама (пас и свиња) показао је делимичну ендотелизацију и урастање миофибробласта примаоца у базу, без знакова калцификације. Примећена је умерена инфламаторна инфилтрација. Међутим, током клиничких испитивања децелуларизоване валвуле SynerGraft™ развио се рани отказ. У матрици биопротезе откривена је изражена инфламаторна реакција, која је у почетку била неспецифична и праћена лимфоцитном реакцијом. Дисфункција и дегенерација биопротезе развиле су се током једне године. Није примећена ћелијска колонизација матрице, али је откривена калцификација валвула и остаци преимплантационих ћелија.

Матрице без ћелија засејане ендотелним ћелијама и култивисане in vitro и in vivo формирале су кохерентни слој на површини залистака, а засејане интерстицијалне ћелије нативне структуре показале су своју способност диференцијације. Међутим, није било могуће постићи потребан физиолошки ниво колонизације ћелија на матрици под динамичким условима биореактора, а имплантиране вештачке срчане залиске пратило је прилично брзо (тромесечно) задебљање услед убрзане пролиферације ћелија и формирања екстрацелуларног матрикса. Стога, у овој фази, употреба матрица без ћелија донора за њихову колонизацију ћелијама има низ нерешених проблема, укључујући имунолошке и инфективне; рад на децелуларизованим биопротезама се наставља.

Треба напоменути да је колаген такође један од потенцијалних биолошких материјала за производњу матрица способних за биоразградњу. Може се користити у облику пене, гела или плоча, сунђера и као бланк на бази влакана. Међутим, употреба колагена је повезана са бројним технолошким потешкоћама. Посебно га је тешко добити од пацијента. Стога је тренутно већина колагенских матрица животињског порекла. Спора биоразградња животињског колагена може носити повећан ризик од инфекције зоонозама, изазвати имунолошке и инфламаторне реакције.

Фибрин је још један биолошки материјал са контролисаним карактеристикама биоразградње. Пошто се фибрински гелови могу направити из крви пацијента за накнадну производњу аутологне матрице, имплантација такве структуре неће изазвати њену токсичну разградњу и инфламаторну реакцију. Међутим, фибрин има недостатке као што су дифузија и испирање у околину и ниска механичка својства.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Вештачки срчани залисци направљени од синтетичких материјала

Вештачки срчани залисци се такође праве од синтетичких материјала. Неколико покушаја производње матрица залистака заснивало се на употреби полиглактина, полигликолне киселине (PGA), полимлечне киселине (PLA), PGA и PLA кополимера (PLGA) и полихидроксиалканоата (PHA). Високо порозни синтетички материјал може се добити од плетених или неплетених влакана и коришћењем технологије испирања сољу. Перспективни композитни материјал (PGA/P4HB) за производњу матрица добија се од неплетених петљи полигликолне киселине (PGA) обложених поли-4-хидроксибутиратом (P4HB). Вештачки срчани залисци произведени од овог материјала стерилишу се етилен оксидом. Међутим, значајна почетна крутост и дебљина петљи ових полимера, њихова брза и неконтролисана деградација, праћена ослобађањем киселих цитотоксичних производа, захтевају даља истраживања и потрагу за другим материјалима.

Употреба аутологних плоча за културу ткива миофибробласта култивисаних на скелу ради формирања носећих матрица стимулисањем производње ових ћелија омогућила је добијање узорака залистака са активним одрживим ћелијама окруженим екстрацелуларним матриксом. Међутим, механичка својства ткива ових залистака су још увек недовољна за њихову имплантацију.

Потребан ниво пролиферације и регенерације ткива залистка који се ствара не може се постићи само комбиновањем ћелија и матрикса. Експресија ћелијских гена и формирање ткива могу се регулисати или стимулисати додавањем фактора раста, цитокина или хормона, митогених фактора или фактора адхезије у матрикс и скеле. Могућност увођења ових регулатора у матриксне биоматеријале се проучава. Генерално, постоји значајан недостатак истраживања о регулацији формирања залистка ткива биохемијским стимулусима.

Ацелуларна свињска ксеногена биопротеза плућа Матрикс П састоји се од децелуларизованог ткива обрађеног посебним патентираним поступком компаније AutoTissue GmbH, укључујући третман антибиотицима, натријум деоксихолатом и алкохолом. Ова метода обраде, одобрена од стране Међународне организације за стандардизацију, елиминише све живе ћелије и постћелијске структуре (фибробласти, ендотелне ћелије, бактерије, вируси, гљивице, микоплазма), чува архитектуру екстрацелуларног матрикса, смањује ниво ДНК и РНК у ткивима на минимум, што своди на нулу вероватноћу преноса свињског ендогеног ретровируса (PERV) на људе. Биопротеза Матрикс П састоји се искључиво од колагена и еластина са очуваном структурном интеграцијом.

У експериментима са овцама, забележена је минимална реакција околних ткива 11 месеци након имплантације биопротезе Matrix P са добрим стопама преживљавања, што је било посебно очигледно на сјајној унутрашњој површини њеног ендокарда. Инфламаторне реакције, задебљање и скраћивање валвула су практично били одсутни. Такође су забележени ниски нивои калцијума у ткиву биопротезе Matrix P, при чему је разлика била статистички значајна у поређењу са онима третираним глутаралдехидом.

Вештачки срчани залистак Matrix P се прилагођава индивидуалним стањима пацијента у року од неколико месеци након имплантације. Преглед на крају контролног периода открио је нетакнут екстрацелуларни матрикс и конфлуентни ендотел. Ксенографт Matrix R имплантиран код 50 пацијената са конгениталним манама током Росове процедуре између 2002. и 2004. године показао је супериорне перформансе и ниже трансвалвуларне градијенте притиска у поређењу са криопрезервираним и децелуларизованим SynerGraftMT алографтима и биопротезама без скелета третираним глутаралдехидом. Вештачки срчани залистци Matrix P намењени су за замену плућног залиска током реконструкције излазног тракта десне коморе у хирургији конгениталних и стечених мана и током замене плућног залиска током Росове процедуре. Доступни су у 4 величине (по унутрашњем пречнику): за новорођенчад (15-17 мм), за децу (18-21 мм), средњу (22-24 мм) и одрасле (25-28 мм).

Напредак у развоју ткивно инжењерских залистака зависиће од напретка у биологији ћелија залистака (укључујући питања експресије и регулације гена), студија ембриогеног и са старењем повезаног развоја залистака (укључујући ангиогене и неурогене факторе), прецизног познавања биомеханике сваког залиска, идентификације адекватних ћелија за засејавање и развоја оптималних матрица. Даљи развој напреднијих ткивних залистака захтеваће темељно разумевање односа између механичких и структурних карактеристика природних залистака и стимулуса (биолошких и механичких) за рекреирање ових карактеристика in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]