Узроци туберкулозе

Породица Mycobacteriaceae из реда Actinomycetales садржи један род Mycobacterium. Године 1975, овај род је садржао око 30 врста, а до 2000. године тај број се већ приближио 100. Већина врста микобактерија је класификована као сапрофитски микроорганизми, широко распрострањени у животној средини.

Група облигатних паразита је безначајна, али је њен практични значај велики и одређен је врстама које изазивају туберкулозу код људи и животиња. Постоји мишљење да су претходници микобактерија патогених за људе биле древне земљишне микобактерије.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Таксономија микобактерија

Све микобактерије су подељене на патогене за људе и опортунистичке.

У клиничкој микробиологији се користи неколико приступа за класификацију микобактерија:

• брзином и оптималном температуром раста, способношћу формирања пигмента;
• за клинички значајне комплексе.

Врсте микобактерија које изазивају туберкулозу обједињене су у комплекс M. tuberculosis, који обухвата M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii. Недавно су му додати M. pinnipedii и M. sarrae, који су филогенетски сродни M. microti и M. bovis.

Преостале микобактерије које изазивају различите микобактериозе класификују се као нетуберкулозне микобактерије. Из ове групе се разликују следећи комплекси: M. avium, коју чине M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M.fortuitum, укључујући подврсте M.fortuitum и M. chelonae, и M. terrae, укључујући M. terrae, M. triviale и M. nonchromogenicum. Најважније групе су патоген лепре M. leprae, као и патоген улцерозних лезија Бурули M. ulcerans.

Ова класификација обједињује врсте микобактерија са истим клиничким значајем, када њихова финија диференцијација није неопходна. Биолошке, биохемијске и молекуларне методе се користе за идентификацију врста унутар група и комплекса.

Класификацију нетуберкулозних микобактерија засновану на културним разликама развио је Рањон 1959. године. Према њој, разликују се 4 групе микобактерија.

Група I - фотохромогене микобактерије

Ова група обухвата микобактерије које нису пигментисане када се гаје у мраку, али добијају јарко жуту или жуто-наранџасту пигментацију након излагања светлости. Потенцијално патогени сојеви који припадају овој групи су M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Међу микобактеријама ове групе постоје и брзорастуће (M. marinum) и спорорастуће (M. asiaticum, M. kansasii). Оптимална температура раста варира од 25 ^° C за M. simiae, 32-33 ^° C за M. marinum до 37 ^° C за M. asiaticum.

Клинички најзначајнија врста у нашој земљи је M. kansasii, која се налази у воденим површинама. Сој M. kansasii (M. luciflavum) изазива болести код људи. Расте у јајној подлози као грубе или глатке колоније, са температурним оптимумом од 37 ^° C. Морфолошки, бактерије су умерене дужине. До сада су описане две варијанте M. kansasii: наранџаста и бела. Када се унесе код заморчића, M. kansasii изазива инфилтрате и збијање регионалних лимфних чворова.

Група II - скотохромогене микобактерије (од грчке речи scotos - тама)

Ова група обухвата микобактерије које формирају пигмент у мраку. Брзина раста је 30-60 дана. Ова група обухвата M. aquae (M. gordonae) и M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum се сматра потенцијално патогеном врстом. На јајној подлози, бактерије ове врсте расту као глатке или храпаве колоније наранџасте боје. Морфолошки, микобактерије су штапићастог облика, кратке или дугачке. Расту на температури од 25-37 ^o C. Код деце изазивају оштећење лимфних чворова и плућа.

M. aquae (M. gordonae) су класификоване као сапрофитске скотохромогене микобактерије. Расту у јајној подлози као наранџасте колоније на температури од 25-37 °C. Морфолошки, микобактерије су штапићастог облика и умерено дугачке (>5 μm). Налазе се у воденим површинама.

Група III - нефотохромогене микобактерије

Ова група обухвата микобактерије које не формирају пигмент или имају бледожуту боју која се не интензивира на светлости. Расту 2-3 или 5-6 недеља. У њих спадају: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (птичје микобактерије) расту на Ловенштајн-Јенсен подлози као пигментисане или слабо пигментисане колоније на 37 ^° C и 45 ^° C. Морфолошки, то су штапићи средње дужине. Могу бити патогени за људе и бројне лабораторијске и домаће животиње (нпр. свиње). Налазе се у води и земљишту.

М. xenopi је изолован из крастаче. Младе културе расту као непигментисане колоније. Касније се појављује жути пигмент. Морфолошки су то дуги нитасти штапићи. Расту на температури од 40-45 ^o C. Условно су патогени за људе.

M. terrae су први пут изоловане из роткве. Расту на Ловенштајн-Јенсен подлози и као колоније без пигмента. Оптимална температура раста је 37 ^° C. Морфолошки су представљене штапићима умерене дужине, сапрофитима.

Група IV - брзорастуће микобактерије

Микобактерије које припадају овој групи карактерише се брзим растом (до 7-10 дана). Расту у облику пигментисаних или непигментисаних колонија, чешће у облику Р-облика. Добар раст се даје 2-5 дана на температури од 25 ^o C. Ова група обухвата потенцијално патогене микобактерије M.fortuitum, као и сапрофитске микобактерије, као што су M. phlei, M. smegmatis, итд. M. fortuitum даје видљив раст на јајној подлози 2-4. дана у облику „розете“. Морфолошки, микобактерије су представљене кратким штапићима. На Ловенштајн-Јенсеновој подлози могу да апсорбују малахитно зелену боју и да постану зелене. Распрострањене су у природи.

Рањонова класификација се показала као веома погодна за идентификацију најчешћих типова микобактерија. Међутим, откриће нових врста и појава све већег броја интермедијарних облика микобактерија узрокује потешкоће у њиховом регистровању у једну или другу Рањонову групу.

М. туберцулоза је млада еволутивна формација. У последње време постоји тенденција да се М. туберцулоза подели на кластере или породице. Најважнији сојеви су они који припадају породици Пекин, који се одликују клонским понашањем и способношћу да изазову микро-епидемије туберкулозе.

Морфологија микобактерија

Микобактерије су танке ћелије штапићастог облика са карактеристичним својством постојаности на киселине и алкохол (у једној од фаза раста), аеробне. Када се боје по Граму, слабо су грам-позитивне. Микобактерије су непокретне, не формирају споре. Конидије или капсуле су одсутне. На густим хранљивим медијумима расту споро или веома споро: на оптималној температури, видљиве колоније се појављују након 2-60 дана. Колоније су ружичасте, наранџасте или жуте, посебно када расту на светлости. Пигмент се не дифундује. Површина колонија је обично мат (С-тип) или храпава (Р-тип). Микобактерије често расту у облику слузавих или набораних колонија. На течним медијумима, микобактерије расту на површини. Нежни суви филм се временом згушњава, постаје неравномерно-наборан и добија жућкасту нијансу. Чорба остаје провидна и дифузни раст се може постићи у присуству детерџената. У микроколонијама M. tuberculosis (тј. у раним фазама), формирају се структуре које подсећају на врпце - карактеристика која је повезана са фактором врпце.

Када се обоје карбол фуксином, микобактерије туберкулозе изгледају као танке, благо закривљене штапиће малинастоцрвене боје, које садрже различит број гранула.

Дужина микобактерија је приближно 1-10 µm, а ширина 0,2-0,7 µm. Понекад се могу наћи закривљене или увијене варијанте. Микроорганизми који се налазе појединачно, у паровима или у групама добро се истичу на плавој позадини других компоненти препарата. Бактеријске ћелије често могу бити распоређене у облику римског броја „V“.

Препарат такође може открити измењене кокоидне киселински отпорне облике патогена, заобљене сферне или мицелијумске структуре. У овом случају, позитиван одговор мора бити потврђен додатним методама.

Структура ћелијског зида микобактерија

Ћелијски зид микобактерија је најсложенији у поређењу са другим прокариотима.

Док грам-негативне бактерије имају две мембране, ћелијски зид микобактерија се састоји од неколико слојева, од којих неки садрже шећере и карактерише их релативно константан састав. Спољашњи слојеви имају променљив хемијски састав и углавном су представљени липидима, од којих је већина миколних киселина и њихових деривата. По правилу, ови слојеви нису видљиви под електронском микроскопијом. Примарни оквир ћелијског зида чине умрежени пептидни гликани - електронски густи слој. Слој арабиногалактана понавља слој пептидних гликана, формирајући полисахаридну строму ћелијског зида. Има тачке повезивања са слојем пептидних гликана и структуре за везивање миколних киселина и њихових деривата.

Миколне киселине су присутне у облику слободних сулфолипида и корд фактора, чије је присуство на површини ћелије повезано са карактеристичним формирањем колонија M. tuberculosis у облику флагела. Јединственост и кључна улога миколних киселина у структурној организацији и физиологији микобактерија чине их одличном метом за етиотропну терапију.

Гликолипидни слој се назива „микозиди“ и понекад се упоређује са микрокапсулом. Микозиди су структурно и функционално слични липополисахаридима спољашње мембране грам-негативних бактерија, али им недостаје њихова агресивност; ипак, токсични су и (као и кордни фактор и сулфолипиди) изазивају стварање гранулома.

Ћелијска мембрана и слојеви ћелијског зида прожети су каналима или порама, међу којима можемо разликовати пасивне поре са кратким животним веком, које обезбеђују контролисану дифузију супстанци, и канале са дужим животним веком, који обезбеђују енергетски зависан транспорт супстанци.

Још једна компонента ћелијског зида микобактерија је липоарабиноманан. Он је усидрен за плазма мембрану, продире кроз ћелијски зид и излази на његову површину. У том погледу, сличан је липотеихојским киселинама грам-позитивних бактерија или липополисахаридном О-антигену грам-негативних бактерија. Терминални фрагменти липоарабиноманана, првенствено његови манозни радикали, неспецифично сузбијају активацију Т-лимфоцита и леукоцита у периферној крви. То доводи до поремећаја имуног одговора на микобактерије.

Варијабилност и облици постојања микобактерија

Перзистенција бактерија има посебан патогенетски значај. Лабораторијски експерименти спроведени in vitro и in vivo показали су да бактерицидни лекови изониазид и пиразинамид убијају микобактерије само у фази репродукције. Ако су микобактерије у фази ниске метаболичке активности (тј. раст бактерија је скоро потпуно суспендован и бактерије се могу назвати „мирујућим“), бактерицидни лекови на њих не утичу. Ово стање се обично назива мирујућим, а микроорганизми се називају перзистенти. Перзистенти нису осетљиви на хемотерапеутске лекове, тј. понашају се као резистентни микроорганизми. У ствари, могу задржати осетљивост на лекове.

Моћан стимуланс за прелазак микобактеријских ћелија у стање мировања су хемотерапеутски лекови, као и фактори имуног система домаћина. Перзистери су у стању да остану у лезијама месецима или чак годинама. Током перзистенције, микобактерије се могу трансформисати у Л-облике. У овом облику, микобактерије показују изузетно ниску метаболичку активност, усмерену првенствено на повећање дебљине ћелијског зида и екстрацелуларног матрикса, што спречава једноставну дифузију супстанци. Поред тога, микобактерије акумулирају генетски материјал, што повећава вероватноћу поновног стварања нормално функционалне ћелије када се појаве повољни услови. Детекција Л-облика стандардним микробиолошким методама је тешка.

Ако успаване микобактерије поврате метаболичку активност и почну да се размножавају током хемотерапије, оне брзо угину. Ако се хемотерапија заврши, такве „оживљене“ микобактерије настављају да се размножавају и изазивају рецидив болести. То објашњава оправданост дугих курсева хемотерапије и примену накнадних кратких профилактичких, обично сезонских, курсева хемопрофилаксије.

Физиологија микобактерија

У царству прокариота, микобактерије су неспорни лидери у области синтезе сложених органских једињења. Вероватно имају најфлексибилнији метаболизам, пружајући неопходну варијабилност за преживљавање како у спољашњој средини, тако и у макроорганизму. До данас је описано више од 100 ензимских реакција, што показује разгранату и сложену природу метаболизма микобактерија. Да би се синтезовала коначна једињења или обезбедиле неопходне физиолошке функције код микобактерија, могу се спроводити паралелни метаболички путеви у зависности од доступности супстрата, хемијског окружења, обезбеђености респираторних циклуса потребним компонентама (јони метала, парцијални притисак кисеоника, угљен-диоксида итд.).

Биохемијска својства микобактерија

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Метаболизам липида

Липиди ћелијског зида, који чине до 60% суве масе ћелије, одређују нестандардна тинкторијална, физиолошка и еколошка својства микобактерија.

Специфични липиди микобактерија описани до данас подељени су у 7 главних група према структурним карактеристикама:

1. деривати масних киселина угљених хидрата (углавном трехалоза - кордни фактор):
2. фосфатидил миоинозитол манозиди:
3. деривати масних киселина пептида;
4. Н-ацилпептидни гликозиди - микозиди Ц;
5. естри масних киселина фтиоцерола;
6. микозиди А, Б. Г;
7. глицерол миколати.

Липиди група 4-6 налазе се само у микобактеријама.

Међу јединственим, вреди напоменути туберкулостеаринску и туберкулопалмитичну киселину, које су прекурсори миколних киселина.

Миколне киселине су група високомолекуларних масних киселина са дужином ланца до 84 атома угљеника, чија је структура главног ланца одређена систематским положајем микроорганизма и условима његовог раста. Њихова ниска реактивност обезбеђује високу хемијску отпорност ћелијског зида микобактерија. Миколати сузбијају ензимско цепање ћелијског зида и реакције слободних радикала.

Кордни фактор је класификован као липидна група 1. Повезан је са високом токсичношћу микобактерија и вируленцијом.

Површински активни липиди, или сулфолипиди, играју важну улогу у интрацелуларној адаптацији микобактерија. Заједно са кордастим фактором, они формирају цитотоксичне мембранотропне комплексе.

Липоарабиноманан је хетерогена смеша високомолекуларних липополисахарида: разгранатих полимера арабинозе и манозе са диацилглицеролним дериватима палмитинске и туберкулостеаринске киселине.

Микозиди Ц су пептидни гликолипиди који формирају спољашњу мембрану микобактерија, што се може посматрати под електронском микроскопијом као провидна зона на периферији ћелија. Микозиди су једињења специфична за врсту. Антигена својства микобактерија зависе од њихове врсте.

Квантитативни и квалитативни састав липидних једињења микобактерија је динамичан и зависи од старости ћелија, састава хранљивих медија и физичко-хемијских карактеристика средине. Младе микобактеријске ћелије почињу да формирају ћелијски зид синтетишући липополисахариде са релативно кратким алифатичним ланцима. У овој фази, оне су прилично рањиве и доступне имуном систему. Како ћелијски зид расте и формирају се високомолекуларни липиди, микобактерије стичу отпорност и равнодушност у својим интеракцијама са имуним системом.

Метаболизам угљених хидрата

Најпожељнији извор угљеника за микобактерије је глицерол.

Најважнији угљени хидрати су арабиноза, маноза и малтоза, који чине више од половине свих сахарида. Поред тога, трехалоза, глукоза, фруктоза, галактоза, рамноза и неки други сахариди играју улогу у виталној активности ћелије. У овом случају, синтеза се одвија дуж хидролазног и алдолазног пута. Пируватни пут се користи за синтезу гликогена. Арабиноза и маноза учествују у формирању важних структурних једињења. Пентозно-фосфатни пут оксидације глукозе користи се за добијање енергије. Обезбеђују га ензими малат, изоцитрат и сукцинат дехидрогеназе, што даје флексибилност респираторном систему.

Глиоксилатни пут, који микобактерије користе за укључивање слободних масних киселина које се акумулирају током раста микобактерија у циклус трикарбоксилних киселина, је јединствен. Овај циклус је привукао пажњу истраживача као могући механизам за хемотаксију микобактерија током перзистенције.

Метаболизам азота и аминокиселина

Брзина коришћења нитрата, нитрита и хидроксиламина од стране микобактерија може се користити за идентификацију врста. Микобактерије преферирају аспарагин као извор азота. Синтеза аминокиселина је енергетски зависан процес и обезбеђује га група ензима који омогућавају коришћење других једињења аминокиселина, као што је глутамат.

Активност нитрит и нитрат редуктазе

Микобактерија туберкулозе може да формира аденозин трифосфат (АТП) преносом електрона дуж ланца носача који се завршава са NO3 уместо са _O2. Ове реакције редукују NO3 _до NH3 _у количинама које су неопходне за синтезу аминокиселина, пуринских и пиримидинских база. То се постиже секвенцијалним деловањем нитрат и нитрит редуктаза.

Активност каталазе и пероксидазе

Каталаза спречава акумулацију водоник-пероксида, који се формира током аеробне оксидације редукованих флавопротеина. Активност ензима зависи од pH вредности средине и температуре. На температури од 56 °C, каталаза није активна. Постоје тестови за припадност патогеном комплексу микобактерија, засновани на термолабилности каталазе.

Познато је да 70% сојева Mycobacterium tuberculosis отпорних на изониазид губи активност каталазе и пероксидазе.

Пероксидазну и каталазну активност спроводи исти ензимски комплекс.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Витамини и коензими

М. tuberculosis садржи витамине Б групе (рибофлавин, пиридоксин, цијанокобаламин, тиамин), витамине Ц и К, пара-аминобензоеву киселину, пантотенску и никотинску киселину, биотин и фолну киселину.

Метаболизам, исхрана и дисање микобактерија

У нормалним, повољним условима, микобактерије туберкулозе су строги аероби и мезофили, односно расту у присуству кисеоника и у температурном опсегу од 30-42 ^o C, најбоље на 37 ^o C. Под неповољним спољашњим условима и/или недостатком кисеоника, микобактерије туберкулозе се манифестују као микроаерофили, па чак и као анаероби. У овом случају, њихов метаболизам претрпља значајне промене.

_{У погледу потрошње кисеоника и развоја оксидазних система, микобактерије су сличне правим гљивицама. Витамин К9} служи као веза између НАДХ дехидрогеназе и цитохрома б у систему преноса рода Mycobacterium. Овај цитохромни систем подсећа на митохондријални. Осетљив је на динитрофенол, баш као и код виших организама.

Описани тип дисања није једини извор формирања АТП-а. Поред О ₂ -терминала, микобактерије могу користити респираторне ланце који преносе електроне и завршавају се нитратима (NO ₃^- ). Резерва респираторног система микобактерија је глиоксилатни циклус.

Аноксично (ендогено) дисање, које се одвија у атмосфери са концентрацијом кисеоника мањом од 1%, стимулише се азидним једињењима, која смањују оксидацију пирувата или трехалозе.

Раст и размножавање микобактерија

Микобактерија туберкулоза се размножава изузетно споро: период удвостручавања је 18-24 сата (нормалне бактерије се деле сваких 15 минута). Стога је за добијање видљивог раста типичних колонија потребно најмање 4-6 недеља. Један од разлога за спору репродукцију микобактерија сматра се њиховом израженом хидрофобношћу, која компликује дифузију хранљивих материја. Вероватније је да је то генетски одређено и повезано са сложенијом структуром микобактерија. Познато је, на пример, да већина бактерија има више копија оперона рибозомалне рибонуклеинске киселине (рРНК). Споро растуће микобактерије (M. tuberculosis, M. leprae) имају једну копију оперона, а брзорастуће (M. smegmatis) - само две копије.

Када се култивишу у течном медијуму, микобактерије расту на површини. Деликатни суви филм се временом згушњава, постаје нераван и наборан, и добија жућкасту нијансу, често упоређену са бојом слоноваче. Чорба остаје провидна, а дифузни раст се може постићи само у присуству детерџената, као што је Tween-80. У микроколонијама (тј. у раним фазама), формирају се структуре које подсећају на снопове - карактеристика повезана са фактором врпце M. tuberculosis.

Генетика микобактерија

Род Mycobacterium је генетски веома разнолик. За разлику од многих сапрофитских и нетуберкулозних микобактерија, Mycobacterium tuberculosis не садржи екстрахромозомске инклузије (нпр. плазмиде). Сва разноликост својстава Mycobacterium tuberculosis одређена је њеним хромозомом.

Геном комплекса M. tuberculosis је изузетно конзервативан. Његови представници имају хомологију ДНК на нивоу од 85-100%, док је ДНК других врста микобактерија хомологна са M. tuberculosis само за 4-26%.

Представници рода Mycobacteria имају велике геноме у поређењу са другим прокариотима - 3,1-4,5x10 ⁹ Da. Међутим, геноми патогених врста су мањи од генома других микобактерија (код M. tuberculosis - 2,5x10 ⁹ Da). Класични узрочник људске туберкулозе, M. tuberculosis, има више гена од M. africanum и M. bovis, који су током еволуције изгубили део свог генетског материјала.

Године 1998. објављена је нуклеотидна секвенца хромозома соја H37Rv M. tuberculosis. Његова дужина је 4.411.529 базних парова. Хромозом микобактерије туберкулозе је прстенасте структуре. Садржи око 4.000 гена који кодирају протеине, као и 60 гена који кодирају функционалне РНК компоненте: јединствени рибозомални РНК оперон, 10Sa РНК. учествује у разградњи протеина са атипичном матриксном РНК. 45 транспортних РНК (тРНК), више од 90 липопротеина.

Више од 20% генома заузимају гени метаболизма масних киселина ћелијског зида, укључујући миколне киселине, киселе полипептиде богате глицином (PE и PPE фамилије), кодиране полиморфним регионима PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) и MPTR (Major polymorphic tandem repeat) генома, респективно (пети и четврти прстен геномске хромозомске мапе). Варијабилност ових геномских региона обезбеђује разлике у антигенима и способност инхибиције имуног одговора. Геном Mycobacterium tuberculosis садржи гене који контролишу факторе вируленције.

Микобактерија туберкулозе синтетише све компоненте неопходне за метаболизам: есенцијалне аминокиселине, витамине, ензиме и кофакторе. У поређењу са другим врстама бактерија, М. туберкулозе има повећану активност ензима липогенезе. Два гена кодирају протеине сличне хемоглобину који делују као антиоксидативни заштитници или замке за вишак ћелијског кисеоника. Ове карактеристике олакшавају брзу адаптацију микобактерије туберкулозе на нагле промене услова околине.

Карактеристична карактеристика генома комплекса M. tuberculosis је велики број понављајућих ДНК секвенци. Тако, хромозом M. tuberculosis H37Rv садржи до 56 копија IS елемената (инсерционих секвенци), који обезбеђују ДНК полиморфизам Mycobacterium tuberculosis. Већина њих, са изузетком елемента IS6110, је непромењена. Хромозоми различитих сојева Mycobacterium tuberculosis обично садрже од 5 до 20 копија IS6110, али постоје сојеви који немају овај елемент. Уз IS елементе, геном садржи неколико врста кратких нуклеотидних понављања (PGRS и MPTR), као и директна понављања DR (Direct Repeat), која се налазе у DR региону и одвојена су варијабилним секвенцама - размакницама (шести прстен на мапи хромозома). Разлике у броју копија и локализацији на хромозому ових генетских елемената користе се за диференцирање сојева Mycobacterium tuberculosis у молекуларној епидемиологији. Најнапредније шеме за генотипизацију микобактерија заснивају се на детекцији геномског полиморфизма изазваног елементом IS6110, као и DR и њиховим размакницама. Карактеристично је да се дивергенција врста M. tuberculosis јавља, по правилу, због рекомбинација између копија елемента IS6110, које окружују различите гене.

Два профага, phiRv1 и phiRv2, пронађена су у геному H37Rv. Као и полиморфно место Dral, вероватно су повезани са факторима патогености, пошто се ови региони генома разликују од сличних региона авирулентних сојева M. tuberculosis H37Ra и M. bom BCG. Идентификовани су региони генома (mutT, ogt-гени) одговорни за повећање стопе мутација и адаптацију микобактерија туберкулозе под условима штампања. Откриће гена окидача за дормантност микобактерија туберкулозе променило је концепт латентне туберкулозне инфекције.

Проучавање полиморфизма гена који кодирају каталазу, пероксидазу и А-подјединицу ДНК гиразе. У комплексу M. tuberculosis идентификоване су три генотипске групе. Најстарија (са становишта еволуције) је група I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis и M. microti. Групе II и III обухватају различите сојеве M. tuberculosis, који су постали широко распрострањени у неким географским регионима. Клонско понашање је карактеристично за групе I и II, а сојеви групе III изузетно ретко изазивају масовне болести. Генетске породице M. tuberculosis, које су добиле имена Харлем, Африка, Филипинска, распрострањене су у различитим регионима света.

Посебно место заузима породица Пекиншка, први пут идентификована у хистолошким препаратима плућног ткива пацијената у предграђима Пекинга 1956-1990. године. До данас су сојеви ове породице пронађени у азијским земљама, Јужној Африци, на Карибима и у Сједињеним Државама. Ширење овог генотипа на различитим територијама одређено је етничким карактеристикама аутохтоног становништва и миграната. Недавно су добијени подаци о ширењу сојева генотипа SI/Пекиншка на северозападу европског дела Русије (Санкт Петербург) и у регионима Сибира.

Отпорност на микобактерије

Током еволуције, микобактерије туберкулозе су развиле различите механизме за превазилажење или инактивацију неповољних фактора средине. Прво, то је моћан ћелијски зид. Друго, то су опсежне метаболичке способности. Способне су да инактивирају многе ћелијске токсине и супстанце (разне пероксиде, алдехиде и друге) које уништавају ћелијску мембрану. Треће, то је морфолошка пластичност, која се састоји у трансформацији микобактерија (формирање Л-облика успаваних ћелија). По својој стабилности, после бактерија које формирају споре, заузимају водеће место у царству прокариота.

Патоген остаје одржив у сувом стању до 3 године. Када се загреју, микобактерије туберкулозе могу да издрже температуре знатно веће од 80°C. Данас се сматра да микобактерије туберкулозе које се налазе у спутуму остају одрживе када се овај други отворено кува 5 минута.

Микобактерија туберкулозе је отпорна на органске и неорганске киселине, алкалије, многе оксидансе, као и на бројне антисептичке и дехидратирајуће супстанце које штетно делују на друге патогене микроорганизме. Микобактерија показује отпорност на дејство алкохола и ацетона.

Примећено је да производи на бази кватернарног амонијума не показују антитуберкулозну активност. Под одређеним условима, концентрације хлора и кисеоничних радикала до 0,5% такође немају штетан ефекат на микобактерије туберкулозе. То подразумева немогућност коришћења таквих производа за стерилизацију спутума и других инфицираних биолошких материјала.

Микобактерија туберкулозе је неосетљива на дифузну сунчеву светлост и може постојати у спољашњој средини дуже од годину дана без губитка одрживости. Краткоталасно ултраљубичасто зрачење има универзално бактерицидно дејство на све микроорганизме. Међутим, у реалним условима, када је микобактерија туберкулозе суспендована у облику ћелијских агломерата са честицама прашине, њихова отпорност на ултраљубичасто зрачење се повећава.

Висока стопа преживљавања микобактерија туберкулозе доприноси изузетно широком ширењу ове инфекције међу становништвом без обзира на климатске услове. Међутим, то није једини фактор који доприноси глобализацији проблема - микобактерије туберкулозе могу дуго да перзистирају у људском телу и да се реактивирају у неограниченим интервалима.

Локализација микобактерије туберкулозе унутар макрофага обезбеђује довољну стабилност супстрата, узимајући у обзир „дуговечност“ мононуклеарних фагоцита и трајање репликације микобактерија, као и изолацију од ефектора хуморалног имунитета. Истовремено, патоген бира биотоп који је неприхватљив за већину микроорганизама због његове потенцијалне опасности. Ову симбиозу обезбеђује низ адаптивних механизама микобактерија.

Процес оштећења макрофага и паразитизма у њему изгледа овако: продор микобактерија у макрофаг без његове активације; сузбијање формирања фаголизозома или њихова трансформација у зону погодну за бактерије; пробој из фагозома у цитоплазму са инактивацијом антимикробних фактора; ометање виталне активности ћелије; слабљење осетљивости макрофага на активирајуће сигнале Т-лимфоцита; смањење антиген-презентујуће функције макрофага и повезано слабљење реакција цитотоксичних Т-лимфоцита конфигурисаних да униште заражене ћелије.

Наравно, карактеристике ћелијског зида играју важну улогу у обезбеђивању овога, као и метаболичке и функционалне способности. При првом контакту са микобактеријама, имуни систем макроорганизма није у стању да активира хуморални имунитет, брзо неутралише и елиминише ћелију из тела, пошто мобилни алифатични ланци микобактеријског зида не дозвољавају процену површинских структура патогена и преносе релевантне информације за синтезу потребног скупа антитела.

Висока хидрофобност микобактерија обезбеђује неспецифичне, тј. рецептор-независне, контакте са макрофагима. Формирањем фагозома око ћелије микобактерије, макрофаг га смешта у себе. Површински микозидни и липоарабиноманански комплекси могу бити препознати рецепторима, али сигнали који се покрећу кроз њих не активирају или слабо активирају макрофаге. Као резултат тога, фагоцитоза није праћена ослобађањем слободнорадикалних облика кисеоника и азота. Сматра се да је ово карактеристичније за вирулентне сојеве M. tuberculosis, који, због структурних карактеристика липоарабиноманана, покрећу „неагресивну“ фагоцитозу. Други макрофагни рецептори, посебно CD 14 и рецептори компоненте комплемента C3 (CR1-CR3), такође учествују у препознавању M. tuberculosis.

Након продирања у макрофаг, микобактерија укључује низ механизама који спречавају формирање фаголизозома: производњу амонијака, који алкализира средину унутар фагозома, синтезу сулфолипида, што доводи до стварања негативног наелектрисања на површини фагозома, што спречава фузију фагозома и лизозома.

Уколико се формира фаголизозом, микобактерија, захваљујући својој моћној воштаној љусци, способна је да угаси реакције слободних радикала изазване бактерицидним супстанцама фагоцита. Амонијум алкализира средину, блокирајући активност лизозомских ензима, а сулфолипиди неутралишу мембранотропне катјонске протеине. Поред тога, микобактерије туберкулозе производе високо активне ензиме са каталазном и пероксидазном активношћу, који се такмиче са пероксидазним системима макрофага, а истовремено инактивирају лизозомске хидропероксиде. Све ово повећава отпорност микобактерија на оксидативни стрес.

Даља адаптација микобактерија састоји се у коришћењу једињења макрофага која садрже гвожђе за њихове ензимске системе и блокирању имуноспецифичних функција макрофага. Макрофаги су један од главних резервоара гвожђа, чији се вишак акумулира у облику феритина. Садржај гвожђа у алвеоларним макрофагима је 100 пута већи него у моноцитима крви, што свакако доприноси њиховој колонизацији микобактеријама туберкулозе.

Микобактерије врше токсичне ефекте на макрофаге помоћу ендотоксина и неспецифичних фактора. Оба првенствено утичу на респираторни систем макрофага - митохондрије. Ендотоксини укључују миколне арабинолипиде, који инхибирају митохондријално дисање. Неспецифични токсини укључују производе синтезе липидног дела микобактеријске ћелије - фтијен и фтионске киселине, које узрокују раздвајање оксидативне фосфорилације. Појачани метаболички процеси под овим условима нису праћени правилном синтезом АТП-а. Ћелије домаћина почињу да осећају енергетско гладовање, што доводи до инхибиције њихове виталне активности, а потом до цитолизе и апоптозе.

Могуће је да се неки фактори патогености формирају само унутар заражених ћелија, као што је случај са другим бактеријама које преферирају интрацелуларни начин живота. На пример, салмонела, паразитирајући унутар макрофага, додатно експресује више од 30 гена. Упркос потпуном опису генома микобактерије туберкулозе, 30% кодона је повезано са протеинима са непознатим својствима.

Резистенција микобактерија на лекове

Са клиничке тачке гледишта, осетљивост микроорганизма на лек одређује да ли се стандардна хемотерапија са назначеним леком може користити за лечење болести изазване изолованим сојем. Резистенција „предвиђа неуспех лечења леком који се тестира“. Другим речима, коришћење стандардне хемотерапије која резултира системском концентрацијом лека која је обично ефикасна под нормалним условима не сузбија пролиферацију „резистентних микроорганизама“.

У микробиологији, дефиниција осетљивости на лекове или резистенције на лекове заснива се на популационом приступу, који подразумева различите степене резистенције пула (хетерогеног скупа) микробних ћелија. Резистенција на лекове се процењује квантитативним карактеристикама, као што је „минимална инхибиторна концентрација“ (МИК). На пример, при МИК-90, 90% микроорганизама угине (бактериостатска концентрација). Дакле, резистенцију треба схватити као њен степен у делу микробне популације, што предодређује неуспех лечења у већини случајева. Општеприхваћено је да 10% резистентних сојева међу целокупном микробном популацијом пацијента може имати патогени ефекат. У фтизиобактериологији, за лекове прве линије против туберкулозе, то је 1%. или 20 јединица које формирају колоније - CFU). Такав део микробне популације је у стању да за месец дана истисне првобитни и формира лезију. За лекове друге линије против туберкулозе, критеријум за резистенцију је повећање микробне популације за 10%.

Развој резистенције на лекове код микроорганизама повезан је са селекцијом у присуству антибиотика и са преференцијалним преживљавањем дела микробне популације који има механизме заштите од антибактеријског средства. Свака популација садржи мали број мутантних ћелија (обично 106 ^-109 ) које су отпорне на одређени лек. Током хемотерапије, осетљиве микробне ћелије умиру, а резистентне ^се множе. Као резултат тога, осетљиве ћелије се замењују резистентним.

Микобактерије у почетку имају високу природну отпорност на многе антибактеријске лекове широког спектра, али различите врсте имају различите спектре и степене ове осетљивости.

Права природна отпорност се схвата као трајна специфична карактеристика микроорганизама за врсту, повезана са одсуством циља за дејство антибиотика или неприступачношћу циља због почетно ниске пропустљивости ћелијског зида, ензимске инактивације супстанце или других механизама.

Стечена резистенција је способност појединачних сојева да остану одрживи при концентрацијама антибиотика које сузбијају раст главног дела микробне популације. Стицање резистенције је у свим случајевима генетски одређено: појава нових генетских информација или промена нивоа експресије сопствених гена.

Тренутно су откривени различити молекуларни механизми отпорности Mycobacterium tuberculosis:

• инактивација антибиотика (инактивација ензима), на пример, β-лактамазама;
• модификација циља деловања (промена просторне конфигурације протеина услед мутације одговарајућег региона генома):
• хиперпродукција мете, што доводи до промене односа агенса и мете и ослобађања дела протеина који одржавају живот бактерије;
• активно уклањање лека из микробне ћелије (ефлукс) због активације механизама одбране од стреса:
• промене у параметрима пропустљивости спољашњих структура микробне ћелије, блокирајући способност антибиотика да продре у ћелију;
• укључивање „метаболичког шанта“ (бајпас метаболички пут).

Поред директног утицаја на метаболизам микробних ћелија, многи антибактеријски лекови (бензилпеницилин, стрептомицин, рифампицин) и други неповољни фактори (биоциди имуног система) доводе до појаве измењених облика микобактерија (протопласти, Л-облици) и такође преводе ћелије у стање мировања: интензитет ћелијског метаболизма се смањује и бактерија постаје неосетљива на дејство антибиотика.

Сви механизми формирају различите степене отпорности, пружајући отпорност на различите концентрације хемотерапијских лекова, тако да појава отпорности код бактерија није увек праћена смањењем клиничке ефикасности антибиотика. Да би се проценила ефикасност и прогноза лечења, важно је знати степен отпорности.

Тренутно је за сваки лек против туберкулозе прве линије и за већину резервних лекова идентификован најмање један ген. Специфичне мутације у којима доводе до развоја резистентних варијанти микобактерија. Код широко распрострањене распрострањености резистенције на лекове код микобактерија, важна је висока стопа мутација in vivo, већа него in vitro.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Врсте резистенције микобактерија на лекове

Прави се разлика између примарне и стечене резистенције на лекове. Микроорганизми са примарном резистенцијом укључују сојеве изоловане од пацијената који нису примали специфичну терапију или су примали лекове месец дана или мање. Ако је немогуће разјаснити чињеницу употребе антитуберкулозних лекова, користи се термин „почетна резистенција“.

Примарна резистенција на лекове је од великог клиничког и епидемиолошког значаја, стога је, ради њене исправне процене, неопходно да се новодијагностикованом пацијенту са туберкулозом не примењује хемотерапија пре микробиолошког прегледа дијагностичког материјала. Учесталост примарне резистенције на лекове израчунава се као однос броја новодијагностикованих пацијената са примарном резистенцијом и броја свих новодијагностикованих пацијената који су тестирани на осетљивост на лекове током године. Ако се резистентни сој изолује код пацијента током антитуберкулозне терапије која се примењује месец дана или дуже, резистенција се сматра стеченом. Учесталост примарне резистенције на лекове карактерише епидемиолошко стање популације туберкулозних узрочника.

Стечена резистенција на лекове код новодијагностикованих пацијената је резултат неуспешног лечења (неправилан избор лекова, непоштовање режима, смањење доза лекова, недоследно снабдевање и лош квалитет лекова). Ови фактори доводе до смањења системске концентрације лекова у крви и њихове ефикасности, док истовремено „покрећу“ одбрамбене механизме у ћелијама микобактерија.

У епидемиолошке сврхе, израчунава се учесталост претходно лечених случајева. У ту сврху узимају се у обзир пацијенти регистровани за поновно лечење након неуспешног курса хемотерапије или рецидива. Израчунава се однос броја резистентних култура Mycobacterium tuberculosis и броја свих сојева тестираних на резистенцију на лекове током године међу пацијентима ове групе у време њихове регистрације.

У структури резистенције на лекове Mycobacterium tuberculosis разликују се следеће:

Монорезистенција - резистенција на један од антитуберкулозних лекова, осетљивост на друге лекове је очувана. Приликом примене комплексне терапије, монорезистенција се детектује прилично ретко и, по правилу, на стрептомицин (у 10-15% случајева код новодијагностикованих пацијената).

Полирезистенција је отпорност на два или више лекова.

Вишеструка резистенција на лекове је резистенција на изониазид и рифампицин истовремено (без обзира на присуство резистенције на друге лекове). Обично је праћена резистенцијом на стрептомицин итд. Тренутно је МДР туберкулозних узрочника постала епидемиолошки опасна појава. Прорачуни показују да откривање узрочника са МДР у више од 6,6% случајева (међу новодијагностикованим пацијентима) захтева промену стратегије Националног програма за борбу против туберкулозе. Према подацима праћења резистенције на лекове, учесталост МДР међу новодијагностикованим пацијентима креће се од 4 до 15%, међу рецидивима - 45-55%, а међу случајевима неуспешног лечења - до 80%.

Суперрезистенција је вишеструка резистенција на лекове комбинована са резистенцијом на флуорокинолоне и један од ињекционих лекова (канамицин, амикацин, капреомицин). Туберкулоза изазвана сојевима са суперрезистенцијом представља директну претњу по животе пацијената, будући да други лекови против туберкулозе друге линије немају изражен антибактеријски ефекат. Од 2006. године, неке земље имају организован надзор над ширењем сојева микобактерија са суперрезистенцијом. У иностранству се ова MDR варијанта обично означава као XDR.

Унакрсна резистенција је када резистенција на један лек доводи до резистенције на друге лекове. Код M. tuberculosis, мутације повезане са резистенцијом обично нису међусобно повезане. Развој унакрсне резистенције је последица сличности хемијске структуре неких антитуберкулозних лекова. Унакрсна резистенција се посебно често детектује унутар једне групе лекова, као што су аминогликозиди. Да би се предвидела унакрсна резистенција, неопходне су генетске студије микобактеријских култура у комбинацији са микробиолошким студијама резистенције.

Нетуберкулозне микобактерије

Нетуберкулозне микобактерије се изузетно ретко преносе са особе на особу. Учесталост изолације неких њихових врста из материјала од пацијената је упоредива са учесталошћу изолације ових врста из објеката животне средине. Извори инфекције могу бити домаће животиње и птице, непрерађени производи. Микобактерије се налазе у материјалу након клања и млеку говеда.

Према подацима бактериолошких лабораторија, преваленција нетуберкулозних микобактерија у периоду 2004-2005. била је 0,5-6,2% међу свим микобактеријама код новодијагностикованих пацијената. Учесталост вероватно може бити нешто већа, с обзиром на то да метода која се користи за обраду дијагностичког материјала није оптимална за нетуберкулозне микобактерије. Сапрофитске микобактерије могу бити присутне у дијагностичком материјалу ако се не поштују правила прикупљања или због карактеристика материјала (на пример, M. smegmatis се може изоловати из урина мушких пацијената).

У том смислу, важно је више пута потврдити откривену врсту микобактерија из материјала пацијента.

Микобактерије утичу на кожу, мека ткива, а могу изазвати и микобактериозу плућа, што је посебно често код имунодефицијенцијалних стања. Са плућном локализацијом, чешће се открива код старијих мушкараца са историјом хроничних плућних болести, укључујући гљивичне лезије.

Од свих микобактерија, комплекс M. avium-intracellulare је најчешћи узрочник плућне микобактериозе код људи. Изазива болести плућа, периферних лимфних чворова и дисеминованих процеса. На северу европског региона, око 60% плућних микобактериоза. Преовлађују фибро-кавернозни и инфилтративни процеси, који попримају хронични ток због високе резистенције на антитуберкулозне лекове.

М. кансасии су узрочници хроничних плућних болести сличних туберкулози. Хемотерапија је ефикаснија због веће осетљивости М. кансасии на антибактеријске лекове. М. ксенопи и М. малмоенсе изазивају углавном хроничне плућне болести. Могу контаминирати системе за снабдевање топлом и хладном водом. Станиште М. малмоенса није у потпуности утврђено. М. ксенопи показује прилично добру осетљивост на антитуберкулозну терапију. М. малмоенсе показује прилично високу осетљивост на антибиотике in vitro, али конзервативни третман је често неефикасан, па чак и фаталан. М. фортуитум и М. келонае су препознати као узрочници болести костију и меких ткива услед директне контаминације ране током трауме, операције и пенетрирајуће повреде. Они узрокују до 10% плућних микобактериоза. Јавља се као хронична деструктивна билатерална лезија, често фатална. Антитуберкулозни лекови и антибиотици широког спектра нису активни или имају малу активност против ових врста микобактерија.

У јужним регионима, микобактериозе коже и меких ткива изазване M. leprae, M. ulceranse су широко распрострањене. Идентификација нетуберкулозних микобактерија се спроводи у лабораторијама водећих антитуберкулозних установа у земљи. То захтева високу квалификацију и добру опремљеност лабораторија.