Молекуларно-генетске методе за дијагностиковање наследних болести

Методе ДНК технологије се користе за одређивање локализације мутантног гена у одређеном хромозому, одговорном за настанак одређених облика наследне патологије. Пошто је ген део ДНК, а генска мутација је оштећење примарне структуре ДНК (мутација се схвата као све промене у ДНК секвенци, без обзира на њихову локализацију и утицај на одрживост јединке), онда је, испитивањем препарата метафазних хромозома пацијента са наследном болешћу, могуће утврдити локализацију патолошког гена. Молекуларно-генетске методе стварају могућности за дијагностиковање болести на нивоу измењене структуре ДНК, омогућавају нам да утврдимо локализацију наследних поремећаја. Молекуларно-генетске методе могу идентификовати мутације повезане са заменом чак и једне једине базе.

Најважнија фаза идентификације гена је његова изолација. ДНК се може изоловати из било које врсте ткива и ћелија које садрже језгра. Фазе изолације ДНК укључују: брзу лизу ћелија, уклањање фрагмената ћелијских органела и мембрана центрифугирањем, ензимско уништавање протеина и њихову екстракцију из раствора употребом фенола и хлороформа, концентровање молекула ДНК таложењем у етанолу.

У генетским лабораторијама, ДНК се најчешће изолује из леукоцита крви, за шта се од пацијента узима 5-20 мл венске крви у стерилну епрувету са раствором антикоагуланса (хепарин). Затим се леукоцити одвајају и обрађују према горе наведеним корацима.

Следећа фаза припреме материјала за истраживање је „сечење“ ДНК на фрагменте у областима са строго специфичном базном секвенцом, што се спроводи помоћу бактеријских ензима - рестрикционих ендонуклеаза (рестрикционих ензима). Рестрикциони ензими препознају специфичне секвенце од 4-6, ређе 8-12 нуклеотида у дволанчаном молекулу ДНК и деле га на фрагменте на местима ових секвенци, названих рестрикциона места. Број резултирајућих рестрикционих фрагмената ДНК одређен је учесталошћу појављивања рестрикционих места, а величина фрагмената одређена је природом расподеле ових места дуж дужине оригиналног молекула ДНК. Што се чешће налазе рестрикциона места, то су краћи фрагменти ДНК након рестрикције. Тренутно је познато више од 500 различитих врста рестрикционих ензима бактеријског порекла, и сваки од ових ензима препознаје своју специфичну нуклеотидну секвенцу. У будућности, рестрикциона места могу се користити као генетски маркери ДНК. Фрагменти ДНК настали као резултат рестрикције могу се сортирати по дужини електрофорезом у агарозном или полиакриламидном гелу, и тако се може одредити њихова молекулска тежина. Типично, ДНК у гелу се идентификује специфичним бојењем (обично етидијум бромидом) и посматрањем гела у пропуштеној ултраљубичастој светлости. Места локализације ДНК су обојена црвено. Међутим, код људи, када се ДНК обрађује помоћу неколико рестрикционих ензима, формира се толико фрагмената различите дужине да се не могу раздвојити електрофорезом, тј. није могуће визуелно идентификовати појединачне фрагменте ДНК на електрофорези (добија се уједначено бојење дуж целе дужине гела). Стога се за идентификацију жељених фрагмената ДНК у таквом гелу користи метод хибридизације са обележеним ДНК пробама.

Било који једноланчани сегмент ДНК или РНК способан је за везивање (хибридизацију) са комплементарним ланцем, при чему се гуанин увек везује за цитозин, а аденин за тимин. Тако се формира дволанчани молекул. Ако се једноланчана копија клонираног гена обележи радиоактивном ознаком, добија се сонда. Сонда је способна да пронађе комплементарни сегмент ДНК, који се затим лако идентификује помоћу ауторадиографије. Радиоактивна сонда додата препарату растегнутих хромозома омогућава локализацију гена на одређеном хромозому: коришћењем ДНК сонде, специфична подручја могу се идентификовати током Саутерн блотинга. Хибридизација се јавља ако тестирани део ДНК садржи нормалан ген. У случају када је присутна абнормална нуклеотидна секвенца, тј. одговарајуће структуре хромозома садрже мутантни ген, хибридизација се неће догодити, што омогућава одређивање локализације патолошког гена.

За добијање ДНК сонди користи се метода клонирања гена. Суштина методе је да се фрагмент ДНК који одговара гену или делу гена убацује у клонирајућу честицу, обично бактеријски плазмид (прстенаста екстрахромозомска ДНК присутна у бактеријским ћелијама и носи гене отпорности на антибиотике), а затим се бактерије са плазмидом са уметнутим људским геном умножавају. Захваљујући процесима синтезе у плазмиду, могу се добити милијарде копија људског гена или његовог дела.

Добијене копије ДНК, обележене радиоактивном ознаком или флуорохромима, се затим користе као сонде за тражење комплементарних секвенци међу проучаваним скупом молекула ДНК.

Тренутно постоји много различитих врста метода које користе ДНК сонде за дијагностиковање генских мутација.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]