Лабораторијска дијагноза туберкулозе

Туберкулоза је болест коју је лако дијагностиковати у савременим условима и научним достигнућима. Лабораторијска дијагностика туберкулозе заузима централно место међу осталим дијагностичким методама, одмах после рендгенских метода прегледа.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Клинички тест крви

Код пацијената са туберкулозом, промене у општој анализи крви нису патогномоничне. Код ограничених и нискоактивних облика туберкулозе карактеристична је хипохромија еритроцита са нормалним бројем. Код масивних инфилтрата или казеозне пнеумоније, са распрострањеним казеозним лимфаденитисом, специфичним оштећењем црева, као и код великих плућних или постоперативних хеморагија, примећују се еритропенија и микроцитоза, олигохромазија, полихромазија. Макроцитоза, а посебно поикилоцитоза, срећу се много ређе, обично код тешке анемије. Број ретикулоцита у компензованој фази туберкулозе варира од 0,1 до 0,6%, у субкомпензованој фази - од 0,6 до 1,0%, а за декомпензовану фазу карактеристично је 1% ретикулоцита.

У неким случајевима туберкулозе може се приметити умерена леукоцитоза (до 15 хиљада леукоцита), ређе леукопенија, која се јавља у 2-7% случајева код пацијената са ограниченим и благим облицима процеса и у 12,5% код деструктивне и прогресивне плућне туберкулозе.

Најчешће се јављају промене у леукоцитној формули. Примећује се и релативна и апсолутна неутрофилија, умерено померање леукоцитне формуле улево ка промијелоцитима. Мијелоцити се веома ретко срећу у случајевима неусложњене туберкулозе. Повећање броја неутрофила са патолошком гранулацијом у хемограму пацијента са туберкулозом увек указује на трајање процеса: код пацијената са тешком туберкулозом, скоро сви неутрофили садрже патолошку гранулацију. Када се епидемија туберкулозе смири, нуклеарни помак се релативно брзо враћа у нормалу. Патолошка гранулација неутрофила обично траје дуже од других промена у хемограму.

Садржај еозинофила у периферној крви такође флуктуира у зависности од фазе процеса и алергијског стања организма. Њихов број се смањује до анеозинофилије код тешких и продужених избијања болести и, обрнуто, повећава се током ресорпције инфилтрата и плеуралног излива, као и код раних облика примарне туберкулозе.

Већину облика примарне туберкулозе прати лимфопенија, која се понекад примећује и неколико година чак и након ожиљавања специфичних промена. Секундарна туберкулоза у акутној фази, у зависности од тежине процеса, може бити праћена или нормалним бројем лимфоцита или лимфопенијом.

Међу тестовима за процену туберкулозног процеса, посебно место заузима одређивање брзине седиментације еритроцита (БСЕ), што је важно у процени тока туберкулозног процеса и идентификацији његових активних облика. Повећање БСЕ указује на присуство патолошког процеса (инфективног и инфламаторног, гнојног, септичког, хемобластозе, лимфогрануломатозе итд.) и служи као индикатор његове тежине, али нормалне вредности БСЕ не указују увек на одсуство патологије. Убрзање седиментације еритроцита олакшава повећање садржаја глобулина, фибриногена, холестерола у крви и смањење вискозности крви. Успоравање седиментације еритроцита карактеристично је за стања праћена хемоконцентрацијом, повећањем садржаја албумина и жучних киселина.

Хемограм оболелих од туберкулозе се мења током лечења. Што је терапијска интервенција успешнија, брже нестају хематолошке промене. Истовремено, треба имати на уму и ефекат различитих антибактеријских лекова на хематопоезу. Они често изазивају еозинофилију, у неким случајевима - леукоцитозу, а чешће леукопенију до агранулоцитозе и лимфоидно-ретикуларну реакцију. Систематско хематолошко праћење и исправна анализа добијених података су неопходни за процену клиничког стања пацијента, динамике процеса и ефикасности лечења.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Клиничка анализа урина

Код туберкулозе уринарног тракта, анализа урина је главна лабораторијска дијагностичка метода. Може се приметити леукоцитурија, еритроцитурија, протеинурија, хипоизостенурија, туберкулозна микобактериурија, неспецифична бактериурија.

Леукоцитурија је најчешћи симптом туберкулозе уринарног тракта пре специфичне хемотерапије и одсутна је само у изузетним случајевима, као што је потпуна облитерација лумена уретера. Нечипоренков тест (одређивање броја леукоцита у 1 мл урина) помаже у објективнијој процени степена леукоцитурије код нефротуберкулозе, а у неким случајевима и у њеном откривању нормалном општом анализом урина. Међутим, треба узети у обзир да се леукоцитурија може јавити код акутног и хроничног пијелонефритиса, циститиса, уретритиса, камена у бубрегу и уретерима.

Еритроцитурија, као и леукоцитурија, сматра се једним од најчешћих лабораторијских знакова генитоуринарне туберкулозе. Учесталост хематурије зависи од преваленције процеса; повећава се како се развија деструктивни туберкулозни процес у бубрегу. Еритроцитурија без леукоцитурије је типичнија за ране стадијуме бубрежне туберкулозе. Хематурија, која преовладава над леукоцитуријом, важан је аргумент у корист бубрежне туберкулозе приликом њеног разликовања од неспецифичног пијелонефритиса.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Биохемијски тест крви

Код туберкулозе, промене неких биохемијских индекса зависе првенствено од фазе процеса, компликација и разних пратећих болести. Код пацијената са неактивном туберкулозом плућа и других органа, укупни протеини и протеинске фракције крвног серума нису промењени и одређују њихов нормалан садржај.

Код акутних облика болести, као и код погоршања и прогресије хроничних облика туберкулозе, коефицијент албумин-глобулина се смањује.

Од значајног значаја у процени функционалног стања и органског оштећења јетре код туберкулозе и њених компликација је одређивање директног и укупног билирубина, аспартат аминотрансферазе (АСТ), аланин аминотрансферазе (АЛТ) у крвном серуму. Динамичко одређивање нивоа аминотрансфераза. билирубина у лечењу пацијената са туберкулозом, посебно у њеним тешким облицима, обавезна је компонента биохемијског прегледа пацијената са туберкулозом и спроводи се месечно.

Процена функционалног стања бубрега обухвата одређивање серумског креатинина и израчунавање брзине гломеруларне филтрације помоћу Кокрофт-Голтове формуле. Израчунавање брзине гломеруларне филтрације помоћу Реберговог теста даје мање тачне резултате.

Главни циљ динамичких биохемијских студија пацијената са туберкулозом је праћење тока процеса, благовремено откривање нежељених ефеката лекова и адекватна корекција насталих поремећаја хомеостазе.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Примена биохемијских метода истраживања код екстрапулмоналне туберкулозе

Најинформативнијим показатељем се сматра садржај туберкулостеаринске киселине у биолошким течностима, међутим, његово одређивање је повезано са техничким потешкоћама (потреба за коришћењем гасне хроматографије и масене спектрометрије).

Обећавајуће је мерење активности аденозин деаминазе - ензима који се одређује у течностима: синовијалној, перикардијалној, асцитној или цереброспиналној. Главни произвођачи аденозин деаминазе су лимфоцити и моноцити. Одређивање активности аденозин деаминазе у биолошким течностима олакшава дијагнозу туберкулозног синовитиса, туберкулозе лимфних чворова, туберкулозног менингитиса, туберкулозног серозитиса.

Неки биохемијски индикатори, због своје неспецифичности, одређују се само у биолошким течностима близу лезије. Ниво индикатора се мери као одговор на субкутану или интрадермалну примену туберкулина (обично пре примене и 48 и 72 сата након ње). Након тога, степен повећања нивоа маркера (у %) се израчунава у односу на почетни ниво.

Оптимално, активност орган-специфичног ензима трансамидиназе одређује се у урину; њена појава се примећује код оштећења бубрега различитог порекла. Проучавање трансамидиназе је оправдано само у условима поткожне примене туберкулина ради погоршања локалног инфламаторног процеса. Активност трансамидиназе се одређује у урину иницијално и 24-72 сата након примене 50 ТЕ туберкулина. Повећање ферментурије за 2 или више пута омогућава у 82% случајева да се диференцира активна туберкулоза бубрега од погоршања хроничног пијелонефритиса.

Код туберкулозе женских гениталних органа, концентрације хаптоглобина и малондиалдехида у крви се одређују под условима провокативног туберкулинског теста. Туберкулин се примењује субкутано у дози од 50 ТЕ и поновљена биохемијска студија се врши након 72 сата. Код туберкулозне етиологије, степен повећања нивоа хаптоглобина је најмање 28%, а ниво малондиалдехида је 39% или више. Такође се користи одређивање активности аденозин деаминазе у перитонеалној течности добијеној из Дугласовог џепа. Пункција се поново испитује 72 сата након интрадермалне примене туберкулина у дозама од 0,1 ТЕ и 0,01 ТЕ у подручју пројекције унутрашњих гениталних органа на предњи трбушни зид. Повећање активности аденозин деаминазе за 10% или више у поређењу са почетном вредношћу указује на туберкулозни процес.

У случају оштећења ока, испитује се фокална реакција која се јавља у оку као одговор на стимулацију антигеном. У овом случају, развој оштро израженог одговора праћеног смањењем визуелних функција је непожељан. Пошто је процена минималних фокалних реакција често тешка, препоручује се паралелно фокусирање на степен повећања хаптоглобина или аденозин деаминазе у крвном серуму ради објективизације закључка.

Све биохемијске студије треба спроводити у комбинацији са другим методама.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Проучавање система коагулације крви

Релевантност проучавања стања система коагулације крви у фтизиологији је због присуства хемоптизе или плућних хеморагија код бројних пацијената са туберкулозом плућа, као и компликација хемокоагулације код хируршког лечења туберкулозе. Поред тога, природно пратећа латентна интраваскуларна хемокоагулација утиче на ток болести и ефикасност хемотерапије.

Код пацијената са плућном туберкулозом са претежно ексудативном компонентом упале, примећује се смањење антикоагулантне активности крви. Код пацијената са ниском преваленцијом специфичног оштећења плућа са претежно продуктивном компонентом упале, интраваскуларна хемокоагулација је незнатно изражена. Код пацијената са плућном туберкулозом са хемоптизом и плућним крварењем, стање система коагулације крви је другачије: код пацијената са мањим губитком крви на врхунцу хемоптизе или непосредно након њеног престанка, примећује се нагло повећање коагулационог капацитета крви због израженог интензивирања процеса стварања тромбина уз одржавање повећане „структурне“ коагулације. Код пацијената са масивним губитком крви, примећује се смањење коагулационог потенцијала због смањења концентрације фибриногена, активности фактора XIII и броја тромбоцита. У фази хируршког лечења код пацијената са ограниченим облицима плућне туберкулозе, не јављају се значајни поремећаји у систему хомеостазе. Код пацијената са раширеним процесима, приликом извођења пнеумонектомије или плеуропнеумонектомије, често се развија DIC синдром, који може имати облик „друге болести“.

Да би се пратило стање система коагулације крви код пацијената са плућном туберкулозом, неопходно је одредити активирано парцијално тромбопластинско време (АПТТ), фибриноген, тромбинско време, протромбински индекс, као и време крварења и време згрушавања крви.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Хормонске студије

Савремена експериментална и клиничка посматрања указују на присуство промена хормонског статуса код специфичне туберкулозне упале плућа. Доказано је да корекција дисфункције хипофизно-надбубрежног, хипофизно-тироидног система и функције панкреаса у комбинацији са антитуберкулозном терапијом доприноси активацији фиброгенезе и процеса репарације у жаришту специфичне упале.

Функционално стање хипофизно-тиреоидног система процењује се садржајем тријодотиронина (Т3), тироксина (Т4) и хипофизног тиреостимулирајућег хормона (ТСХ) у крвном серуму _. Утврђено _је да се субклинички хипотиреоидизам открива код 38-45% пацијената са плућном туберкулозом, а најчешће се дијагностикује код дисеминованог и фиброзно-кавернозног облика процеса. Код ових облика, нивои и Т3 и Т4 су најоштрије смањени _, а долази до _{неравнотеже} ових хормона у облику повећања _{односа Т4/} Т3.

Функција надбубрежне коре процењује се нивоом серумског кортизола, а ендокрина функција панкреаса концентрацијом имунореактивног инсулина. У акутној фази заразне болести, потреба за ендогеним кортизолом и инсулином се повећава. Хиперинсулинемија такође указује на инсулинску резистенцију телесних ткива, што је типично за сваки активни инфламаторни процес, посебно специфичан. Одређивање глукокортикоидне функције надбубрежних жлезда код активне плућне туберкулозе омогућава нам да откријемо присуство хиперкортицизма код већине пацијената. Нормалне концентрације кортизола у крви код пацијента са инфективном упалом у акутном периоду треба сматрати релативном инсуфицијенцијом глукокортикоидне функције надбубрежне коре, што може послужити као основа за супституциону терапију адекватним дозама глукокортикоида.

Скоро трећина пацијената са плућном туберкулозом има низак ниво инсулинемије који се приближава доњој граници норме, док 13-20% има значајан хиперинсулинизам. И релативни хипо- и хиперинсулинизам су фактори високог ризика за развој поремећаја метаболизма угљених хидрата различитог степена тежине. Ове промене у функционалној активности панкреасних Б-ћелија захтевају редовно праћење гликемије код пацијената са туберкулозом и благовремену превенцију дијабетес мелитуса. Поред тога, ово служи као додатно оправдање за прикладност употребе физиолошких доза инсулина у комплексној терапији туберкулозе.

Генерално, смањење нивоа тироидних хормона, њихов дисбаланс, хиперкортизолемија и хиперинсулинизам су најизраженији код пацијената са тешким током туберкулозног процеса, са опсежним плућним лезијама и израженим симптомима туберкулозне интоксикације.

Микробиолошка дијагностика туберкулозе

Микробиолошке студије су неопходне за идентификацију пацијената са туберкулозом, верификацију дијагнозе, праћење и корекцију хемотерапије, процену исхода лечења, другим речима, од тренутка када је пацијент са туберкулозом регистрован до тренутка када се уклони из регистра.

Сви епидемиолошки програми и пројекти заснивају се на процени броја бактериоекскретора, што је немогуће учинити без употребе лабораторијских метода за откривање микобактерија туберкулозе. Приликом испитивања привлачности такозване неорганизоване популације, проценат бактериоекскретора достиже 70 или више, што лабораторијске методе чини прилично ефикасним средством за идентификацију пацијената са туберкулозом међу овом популационом групом.

Традиционалне микробиолошке методе дијагностиковања туберкулозе су бактериоскопске и културолошке студије. Модерне методе укључују култивацију микобактерија туберкулозе у аутоматизованим системима и ПЦР. Међутим, све ове методе се нужно комбинују са класичним бактериолошким методама.

Прикупљање дијагностичког материјала

Ефикасност лабораторијских тестова у великој мери зависи од квалитета дијагностичког материјала. Усклађеност са правилима за прикупљање, складиштење и транспорт дијагностичког материјала и прецизна примена алгоритма прегледа пацијента директно утиче на резултат и обезбеђује биолошку безбедност.

За тестирање на туберкулозу користи се различит материјал. Пошто је плућна туберкулоза најчешћи облик туберкулозне инфекције, главним материјалом за тестирање сматра се спутум и друге врсте трахеобронхијалног исцедка: исцедак горњих дисајних путева добијен након инхалације аеросола: воде бронхијалних лаважа; бронхоалвеоларни лаважи; материјал добијен током бронхоскопије, транстрахеалне и интрапулмоналне биопсије: бронхијални аспират, брисеви ларингеала, ексудати, брисеви рана итд.

Ефикасност истраживања се повећава ако се спроводи контролисано прикупљање материјала од пацијента. У ту сврху се додељује посебно опремљена просторија или се купују посебне кабине. Прикупљање материјала је опасан поступак, стога се материјал за истраживање мора прикупљати у складу са правилима безбедности од инфекција.

Материјал за тестирање на Mycobacterium tuberculosis се сакупља у стерилним бочицама са чврсто затвореним поклопцима како би се спречила контаминација околине и заштитио сакупљени материјал од контаминације.

Бочице за сакупљање дијагностичког материјала морају испуњавати следеће захтеве:

• мора бити направљен од материјала отпорног на ударце;
• требало би лако да се топи када се аутоклавира;
• бити довољне запремине (40-50 мл):
• имају широк отвор за сакупљање спутума (пречник не мањи од 30 мм);
• бити лак за руковање, провидан или провидан, тако да се количина и квалитет прикупљеног узорка могу проценити без отварања поклопца.

Да би се постигли оптимални резултати истраживања, морају бити испуњени следећи услови:

• сакупљање материјала треба обавити пре почетка хемотерапије;
• материјал за студију мора се сакупити пре јела или узимања лекова ујутру;
• За студију је препоручљиво прикупити најмање 3 јутарња узорка спутума. Спутум се сакупља 3 узастопна дана;
• Прикупљени материјал мора бити достављен у лабораторију што је пре могуће:
• у случајевима када је немогуће одмах доставити материјал у лабораторију, он се чува у фрижидеру на температури ваздуха од 4 °C не дуже од 48 сати;
• Приликом транспорта материјала потребно је обратити посебну пажњу на интегритет боца.

Правилно сакупљени спутум има мукозни или мукопурулентни карактер. Оптимална запремина испитаног дела спутума је 3-5 мл.

Спутум се сакупља под надзором здравственог радника. Особе одговорне за сакупљање спутума морају осигурати да се поштују одређена правила:

• Потребно је пацијенту објаснити сврху прегледа и потребу да искашља не пљувачку или назофарингеални слуз, већ садржај дубоких делова респираторног тракта. То се може постићи као резултат продуктивног кашља који се јавља након неколико (2-3) дубоких удисаја. Такође је потребно упозорити пацијента да прво мора испрати уста прокуваном водом како би се уклонио главни део микрофлоре која вегетира у усној дупљи и остаци хране који компликују преглед спутума;
• Медицински радник који се бави сакупљањем спутума, поред хаљине и капе, мора носити маску, гумене рукавице и гумену кецељу;
• Стојећи иза пацијента, саветује му се да држи бочицу што ближе уснама и да одмах одвоји спутум у њу док га искашљава, при чему је потребно осигурати да је проток ваздуха усмерен даље од здравственог радника:
• Када се заврши сакупљање спутума, здравствени радник треба пажљиво да затвори бочицу поклопцем и процени количину и квалитет сакупљеног спутума. Бочица се затим етикетира и ставља у посебну кутију за транспорт до лабораторије.

Ако пацијент не производи спутум, онда му ноћ пре и рано ујутру на дан сакупљања материјала треба дати експекторанс: екстракт корена белог слеза (мукалтин), бромхексин, амброксол итд. - или треба користити иритирајућу инхалацију, користећи опрему инсталирану у просторији за сакупљање спутума. Материјал сакупљен на овај начин не подлеже конзервацији и треба га прегледати на дан сакупљања. Да би се избегло његово „одбацивање“ у лабораторији, у упутници треба направити посебну напомену.

Уколико се микробиолошке студије не спроводе у датој установи, прикупљени дијагностички материјал мора се централно доставити у лабораторију, под условом да се материјал између испорука чува у фрижидеру или са конзервансима. Материјал се доставља у лабораторију у транспортним кутијама које се лако дезинфикују. Сваки узорак мора бити снабдевен одговарајућом етикетом, а цела серија мора имати попуњен пратећи образац.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Начини и учесталост прегледа пацијената

Током почетног, такозваног дијагностичког, прегледа пацијента на туберкулозу, потребно је испитати најмање 3 порције спутума сакупљених под надзором медицинског особља током 2 или 3 дана, што повећава ефикасност микроскопије.

Примарни скрининг за туберкулозу требало би да спроводе све медицинске и дијагностичке установе здравственог система. У последње време, како би се повећала ефикасност примарног прегледа, на бази клиничких дијагностичких лабораторија организовани су такозвани центри за микроскопију, опремљени савременим микроскопима и опремом за обезбеђивање епидемијске безбедности.

Антитуберкулозне установе користе шему истраживања која предвиђа најмање 3-струки преглед спутума или другог дијагностичког материјала у року од 3 дана. Током лечења, микробиолошке студије се редовно спроводе најмање једном месечно у фази интензивне хемотерапије. Приликом преласка на фазу праћења, студије се спроводе ређе - у интервалима од 2-3 месеца, док се учесталост студија смањује на два.

Карактеристике прикупљања дијагностичког материјала за екстрапулмоналну туберкулозу

Карактеристика патолошког материјала код екстрапулмоналних облика туберкулозе је ниска концентрација микобактерија туберкулозе у њему, што захтева осетљивије методе микробиолошког истраживања, пре свега методе сетве на хранљиву подлогу.

Код генитоуринарне туберкулозе, урин је најприступачнији материјал за испитивање. Прикупљање урина треба да обавља специјално обучена медицинска сестра.

Спољашњи гениталије се перу водом и сапуном или слабим раствором калијум перманганата. Спољашњи отвор уретре се пажљиво третира. Средњи део јутарњег урина се сакупља у стерилну бочицу: код мушкараца - природно, код жена - помоћу катетера. Урин из бубрежне карлице се сакупља у стерилне епрувете током катетеризације једног или два бубрега, у овом другом случају - обавезно одвојено од сваког бубрега. Мала количина овог урина се центрифугира, седимент се испитује.

Код мушкараца, сперма, пункције тестиса и секрет простате се центрифугирају да би се добио седимент. Са било којом локализацијом специфичног процеса у гениталном подручју код мушкараца, масажа простате може подстаћи ослобађање секрета који садрже микобактерије туберкулозе.

Менструална крв се сакупља од жена усисавањем или помоћу Кафкине капе. Добијени материјал се ослобађа еритроцита испирањем дестилованом водом, а затим центрифугирањем. Седимент се испитује.

Испуштање из цервикалног канала материце се сакупља у неку посуду или Кафкину капу, односно пожељно је акумулирати 1-2 мл патолошког материјала.

Материјал добијен током хируршких интервенција на бубрезима, гениталијама, биопсије, стругања ендометријума, хомогенизује се. Да би се то урадило, ставља се у стерилни аванд и темељно уситњава стерилним маказама. У добијену суспензију се додаје стерилни речни песак у количини једнакој њеној маси, затим се додаје 0,5-1,0 мл изотоничног раствора натријум хлорида и све се млеве док се не формира кашаста маса уз додатак изотоничног раствора натријум хлорида (4-5 мл). Затим се маса остави да се слегне 1-1,5 минута, супернатант се испитује.

Туберкулоза костију и зглобова. Пункција (гној из апсцеса) добијена стерилним шприцем ставља се у стерилну посуду и одмах доставља у лабораторију. Стерилном пипетом, претходно навлаженом стерилним изотоничним раствором натријум хлорида, узима се 2-5 мл гноја, пребацује се у бочицу са перлицама и додаје се још 2-3 мл изотоничног раствора натријум хлорида. Бочица се затвара чепом и мућка у мућкалици 8-10 минута. Хомогенизована суспензија се испитује.

Код фистулних облика остеоартикуларне туберкулозе, гној се узима из фистуле. Обилни исцедак се сакупља директно у епрувету. У случајевима оскудног гнојног исцедка, фистулни тракт се испира стерилним изотоничним раствором натријум хлорида, а испирани течности сакупљене у епрувету или комад тампона натопљеног гнојем шаљу се на испитивање.

Хируршки материјал добијен током хируршких интервенција на костима и зглобовима може се састојати од гнојно-некротичних маса, гранулација, ожиљног ткива, коштаног ткива, ткива синовијалне мембране и других супстрата. Његова обрада се врши као код бубрежне туберкулозе.

Микробиолошки преглед синовијалне течности у 3% раствору натријум цитрата (у односу 1:1) ради спречавања згрушавања врши се одмах након пункције.

Туберкулоза лимфних чворова. Гној извађен током пункције лимфних чворова се испитује на исти начин као и гној из апсцеса. Ткиво лимфних чворова добијено током хируршких интервенција и биопсија се испитује као и код других облика туберкулозе.

Студија фецеса за Mycobacterium tuberculosis се изузетно ретко спроводи због готово потпуног одсуства позитивних резултата.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Микроскопија микобактерија

Микроскопија спутума је релативно брза, једноставна и јефтина метода коју треба користити у свим случајевима где се сумња на туберкулозу. Поред тога, ова студија се спроводи ради процене ефикасности хемотерапије и потврде опоравка или неуспеха лечења у одсуству резултата културе.

Користе се две методе микроскопског испитивања:

• метода директне микроскопије, када се размаз припрема директно из дијагностичког материјала;
• метода микроскопије седимента припремљеног од материјала третираног деконтаминантима за културолошка истраживања.

Прва метода се користи у оним лабораторијама где се спроводе само микроскопске студије (клиничке дијагностичке лабораторије опште медицинске мреже).

Најбољи резултати микроскопског прегледа добијају се концентровањем дијагностичког материјала (на пример, центрифугирањем).

Да би се микроскопијом са 50% вероватноће открила Mycobacterium tuberculosis, 1 ml спутума мора да садржи више од 5.000 микробних ћелија. Спутум пацијената са плућним облицима туберкулозе обично садржи значајан број бактерија отпорних на киселину, што омогућава њихово поуздано откривање бактериоскопијом. Дијагностичка осетљивост ове методе може се повећати испитивањем више узорака спутума од једног пацијента. Негативан резултат бактериоскопског прегледа не искључује дијагнозу туберкулозе, јер спутум неких пацијената садржи мање Mycobacterium него што се може открити микроскопијом. Лоша припрема брисева спутума такође може бити узрок негативног резултата бактериоскопског прегледа.

Најчешћа метода за детекцију ацилодезистентних микобактерија у размазу је бојење по Цил-Нилсену. Метода се заснива на продору карбол фуксина у микробну ћелију кроз мембрану која укључује воштано-липидни слој, уз истовремени ефекат загревања и јаког нагризајућег дејства фенола. Накнадно обезбојавање размаза 25% раствором сумпорне киселине или 3% хлороводоничним алкохолом доводи до обезбојавања свих структура које нису ацилодезистентне. Обезбојени елементи размаза боје се 0,3% раствором метилен плавог. Микобактерије не перципирају конвенционалне анилинске боје, због чега се ацилодезистентне микобактерије боје малинастоцрвено, а други микроби и ћелијски елементи се боје плаво.

За испитивање размаза обојених по Цил-Нилсену користи се светлосни бинокуларни микроскоп са имерзионим објективом (увећање од 90 или 100 пута) и окулар са увећањем од 7 или 10 пута. Испитује се 100 видних поља, што је довољно за детекцију појединачних микобактерија у размазу. Ако је резултат таквог испитивања негативан, препоручује се испитивање још 200 видних поља ради потврде. Резултати се бележе, а указују на број детектованих ацидо-резистентних микобактерија (АФБ).

Поред ове методе, за луминесцентну микроскопију се користи флуорохромно бојење, што омогућава постизање најбољих резултата. Употреба ове методе повећава ефикасност микроскопије за 10-15%. Када се микобактерије третирају луминесцентним бојама (аурамин, родамин, итд.), ове супстанце се такође везују за воскасте структуре микробне ћелије. Када се обојене ћелије озраче узбудљивим извором светлости (одређени спектар ултраљубичастог зрачења), оне почињу да светле наранџасто или јарко црвено на црној или тамнозеленој позадини. Због високе осветљености и контраста видљиве слике, укупно увећање микроскопа може се смањити за 4-10 пута, што проширује видно поље и смањује време гледања препарата. Уз то, због знатно веће дубине поља, може се повећати и удобност проучавања.

Приликом коришћења флуоресцентне микроскопије, посматрање истог подручја размаза траје знатно мање времена него светлосна микроскопија размаза обојених по Цил-Нилсену. Ако микроскописта током радног дана прегледа приближно 20-25 таквих размаза, онда уз помоћ флуоресцентне микроскопије може да испита више од 60-80 узорака у исто време. Искусни микроскописти знају да је бојење ћелија смешом аурамина и родамина на неки начин специфично за киселински отпорне микобактерије, које у овом случају имају изглед златних штапића. Сапрофити се боје зеленкасто.

Још једна важна предност методе флуоресцентне микроскопије је могућност детекције измењених микобактерија које су изгубиле своја својства отпорна на киселине под утицајем низа неповољних фактора, посебно интензивне хемотерапије, и стога се не детектују бојењем по Цил-Нилсену.

Недостаци методе флуоресцентне микроскопије укључују релативно високу цену микроскопа и његовог рада. Међутим, у централизованим или другим великим лабораторијама, где оптерећење посла прелази норму од три лабораторијска техничара који раде са три конвенционална микроскопа, јефтиније је користити један флуоресцентни микроскоп.

Бактериоскопске методе имају прилично високу специфичност (89-100%). Око 97% позитивних резултата добијених било којом методом микроскопије јасно је потврђено резултатима сетве.

Треба напоменути да микроскопски преглед размаза патолошког материјала не дозвољава да се утврди врста детектованих киселиноотпорних микобактерија. Микроскопска метода омогућава да се извуче закључак само о присуству или одсуству киселиноотпорних микроорганизама у препарату, што се објашњава постојањем у природи великог броја нетуберкулозних киселиноотпорних микроорганизама морфолошки сличних микобактеријама туберкулозног комплекса.

Евалуација резултата микроскопије се врши у полуквантитативним јединицама.

Да би се могли упоредити резултати различитих метода микроскопије, уводе се емпиријски коефицијенти. На пример, да би се упоредили резултати размаза обојеног флуоресцентним бојама са подацима студије светлосне микроскопије (увећање од 1000 пута), потребно је поделити број киселински отпорних микобактерија откривених помоћу флуоресцентног микроскопа одговарајућим коефицијентом: при увећању микроскопа од 250 пута - са 10, при увећању микроскопа од 450 пута - са 4, при 630 пута - са 2.

Карактеристике микроскопије код екстрапулмоналне туберкулозе

Изводи се директна микроскопија, као и микроскопија размаза припремљених након обогаћивања са накнадним бојењем по Цил-Нилсену или флуоресцентним бојама. Директна микроскопија размаза је неефикасна због ниске концентрације микобактерија у материјалу, те је стога рационалније користити методе обогаћивања. Центрифугирање је најефикасније. Ако је биолошки материјал вискозан, користи се центрифугирање са истовременом хомогенизацијом и утечњавањем материјала, које се спроводи помоћу брзих центрифуга са силом центрифугирања од 3000 g и раствора хипохлорита. Друге методе обогаћивања, као што је микрофлотација, тренутно се не користе због стварања биолошки опасних аеросола.

[ 37 ]

Метода културе за дијагностиковање туберкулозе

Метода сејања, или метода културе, је осетљивија од микроскопије размаза и има низ предности у односу на ову другу. Омогућава детекцију неколико десетина одрживих микобактерија у материјалу који се испитује и има високу дијагностичку вредност. Ово је посебно важно приликом испитивања материјала од новодијагностикованих или лечених пацијената који излучују мали број микобактерија.

У поређењу са микроскопијом, истраживање културе омогућава повећање броја откривених пацијената са туберкулозом за више од 15-25%, као и верификацију туберкулозе у ранијим фазама, када се болест још увек лако може лечити. Веома важном предношћу истраживања културе сматра се могућност добијања културе патогена, која се може идентификовати и проучавати у односу на осетљивост на лекове, вируленцију и друга биолошка својства.

Недостаци метода узгоја укључују њихово трајање (период чекања на материјале достиже 10 недеља), већу цену и сложеност обраде дијагностичког материјала.

Принципи предсетвене обраде дијагностичког материјала

Конвенционалне микробиолошке методе се не могу користити за спровођење тестова на туберкулозу. То је због чињенице да микобактерије туберкулозе расту веома споро, а већина клиничких узорака садржи брзорастуће пиогене и трулежне микроорганизме и гљивице. Њихов брз раст на богатим хранљивим медијумима омета развој микобактерија и не дозвољава изолацију узрочника туберкулозе, па се дијагностички материјал мора претходно третирати пре сетве. Поред тога, микобактерије ослобођене из респираторног тракта пацијента обично су окружене великом количином слузи, што отежава њихову концентрацију. У том смислу, пре сетве спутума и других сличних материјала, они морају бити утечњени и деконтаминирани.

Сви детерџенти и деконтаминанти имају мање или више изражен токсични ефекат на микобактерије. Као резултат третмана, до 90% микобактерија може угинути. Да би се сачувао довољан део популације микобактерија, неопходно је користити нежне методе третмана које омогућавају, с једне стране, сузбијање брзорастућих гнојних и трулежних микроорганизама, а са друге стране, максимално очување одрживости микобактерија присутних у материјалу.

У зависности од материјала, његове хомогености и нивоа контаминације, за третман пре сетве користе се различита средства за деконтаминацију: за спутум - 4% раствор натријум хидроксида, 10% раствор тринатријум фосфата, бензалконијум хлорид тринатријум фосфат, NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеин-натријум хидроксид) са коначном концентрацијом NaOH од 1%, за урин и друге течне материјале - 3% раствор сумпорне киселине, за контаминиране узорке, материјале који садрже масти - раствор оксалне киселине до 5%. Поред тога, у неким случајевима се користе ензими и сурфактанти (детерџенти). Употреба Tween-а и неких других детерџената праћена је мањом смрћу микобактеријских ћелија (40-50% преживи). Међутим, могу се користити само за течне материјале. NALC-NaOH, произведен у комплетима, најшире се користи у свету. Ова метода омогућава изолацију више од 85% популације микобактеријских ћелија. Деконтаминација чврстих материјала који садрже ткиво је тежа, јер је тешко погодити степен дисперзије материјала током хомогенизације. На пример, обрада биопсија лимфних чворова често је праћена повећаном учесталошћу контаминације страном флором. У овом случају, може се користити 1% етониј.

Нехомогени материјал се хомогенизује помоћу стаклених перли у присуству деконтаминанта. Течни материјали се претходно центрифугирају и обрађује се само седимент.

Техника сетве и инкубације

Након претходне обраде, материјал се центрифугира, што таложи микобактерије и повећава њихов садржај у седименту („обогаћивање седимента“). Добијени седимент се неутралише и инокулира на површину густих хранљивих подлога или епрувета са течним (полутечним) подлогама. Из преосталог седимента припремају се размази за микроскопски преглед. Техника сејања мора спречити унакрсну контаминацију дијагностичког материјала.

За поуздано клиничко тумачење резултата микробиолошких истраживања, мора се поштовати следеће правило: микроскопске и културолошке студије морају се спроводити паралелно из истог узорка дијагностичког материјала.

Инокулиране епрувете се стављају у термостат на 37 ^o C током 2 дана у хоризонталном положају. Ово обезбеђује равномернију апсорпцију материјала у хранљиву подлогу. Након 2 дана, епрувете се померају у вертикални положај и херметички затварају гуменим или силиконским чеповима како би се спречило исушивање засејаних подлога.

Усеви се држе у термостату на 37 ^° C током 10-12 недеља уз редовну недељну инспекцију. Следећи параметри се бележе при свакој контролној инспекцији:

• период визуелно видљивог раста од дана сетве;
• стопа раста (број CFU);
• контаминација културе страном микробном флором или гљивицама (такве епрувете се уклањају);
• нема видљивог раста. Цеви се остављају у термостату до следећег прегледа.

Хранљиве подлоге

За култивацију микобактерија користе се различите хранљиве подлоге: чврсте, полутечне, течне. Међутим, ниједна од познатих хранљивих подлога нема својства која обезбеђују раст свих микобактеријских ћелија. У том смислу, ради побољшања ефикасности, препоручује се истовремена употреба 2-3 хранљиве подлоге различитог састава.

Као стандардну подлогу за примарну изолацију узрочника туберкулозе и одређивање његове осетљивости на лекове, СЗО препоручује Ловенштајн-Јенсенову подлогу. То је густа јајна подлога на којој се добија раст микобактерија 20-25. дана након сетве бактериоскопски позитивног материјала. Сетва бактериоскопски негативног материјала захтева дужи период инкубације (до 10-12 недеља).

У нашој земљи је широко распрострањена јајна подлога Фин-II коју је предложио Е. Р. Фин. Разликује се по томе што уместо Л-аспарагина користи натријум глутамат, који покреће друге путеве за синтезу аминокиселина код микобактерија. Раст се на овој подлози појављује нешто раније, а учесталост изолације микобактерија је 6-8% већа него на Ловенштајн-Јенсен подлози.

Ради повећања ефикасности бактериолошке дијагностике екстрапулмоналне туберкулозе, препоручљиво је у комплекс хранљивих подлога укључити модификоване Finn-II подлоге. Ради убрзања раста, у Finn-II хранљиву подлогу се додатно уноси 0,05% натријум тиогликолата, што смањује концентрацију кисеоника. Ради заштите ензимских система микобактерија од токсичних продуката липидне пероксидације, у Finn-II хранљиву подлогу се уноси антиоксиданс α-токоферол ацетат у концентрацији од 0,001 μг/мл. Дијагностички материјал се сеје стандардном методом.

У лабораторијама за борбу против туберкулозе у Русији користе се и друге модификације густих хранљивих подлога: хранљива подлога „Новаја“ коју је предложио Г. Г. Мордовски, хранљиве подлоге А-6 и А-9 које је развио В. А. Аникин, итд.

Због чињенице да током хемотерапије долази до оштећења различитих метаболичких система микробне ћелије, део микобактеријске популације губи способност нормалног развоја на конвенционалним хранљивим медијумима и захтева осмотски уравнотежене (полутечне или течне) хранљиве подлоге.

Евалуација и евидентирање резултата дијагностичке материјалне културе

Неки сојеви и врсте микобактерија расту споро, раст се може појавити чак и до 90. дана. Број таквих култура је мали, али то приморава сетве да се држе у термостату 2,5-3 месеца.

Вирулентне културе Mycobacterium tuberculosis обично расту на чврстим јајним медијумима као R-облици колонија различите величине и изгледа. Колоније су суве, наборане, боје слоноваче и благо пигментисане. На другим медијумима, колоније Mycobacterium tuberculosis могу бити влажније. Након курса хемотерапије или током лечења, могу се изоловати глатке колоније са влажним растом (S-облици).

Приликом изоловања култура, користи се скуп посебних студија за разликовање туберкулозних микобактерија од нетуберкулозних микобактерија и киселински отпорних сапрофита.

Позитиван одговор се даје након обавезног микроскопског прегледа бриса из узгајаних колонија обојених по Цил-Нилсену. У случају раста микобактерија, у брисевима се налазе јарко црвени штапићи, који леже појединачно или у групама, формирајући кластере у облику филца или плетеница. У младим културама, посебно оним изолованим од пацијената који су дуго лечени хемотерапијом, микобактерије се одликују израженим полиморфизмом, до присуства кратких, готово кокоидних или издужених варијанти које подсећају на гљивични мицелијум, заједно са облицима у облику штапића.

Интензитет раста микобактерија означен је према следећој шеми: (+) - 1-20 CFU у епрувети (ниско излучивање бактерија); (++) - 20-100 CFU у епрувети (умерено излучивање бактерија); (+++) - >100 CFU у епрувети (обилно излучивање бактерија). У лабораторијској дијагностици туберкулозе није довољно дати одговор који указује на то да ли су микобактерије откривене одређеном методом. Такође је неопходно имати детаљну представу о количини и природи популације микобактерија, њеном саставу и својствима. Управо ови подаци омогућавају правилно тумачење стања процеса, планирање тактике и благовремено прилагођавање лечења.

Последњих година, за убрзавање раста микобактерија предложене су хранљиве подлоге на бази агара са различитим адитивима за раст и употреба посебне мешавине гасова. Да би се постигао раст микобактерија на овим подлогама, током култивације се ствара атмосфера са повећаним садржајем угљен-диоксида (4-7%). У ту сврху користе се посебни CO2 инкубатори _. Међутим, највећи развој су добили аутоматизовани системи за култивацију микобактерија: MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact.

Један од таквих система је систем MGIT (микобактеријска епрувета за индикатор раста), који је високотехнолошки развој и намењен је за убрзану бактериолошку дијагностику туберкулозе и одређивање осетљивости микобактерија на лекове прве линије и неке лекове друге линије. MGIT је намењен за употребу као део уређаја VASTEC-960. Микроорганизми се гаје у посебним епруветама са течном хранљивом подлогом на бази модификоване подлоге Middlebrook-7H9. За стимулацију раста микобактерија и сузбијање раста стране микрофлоре користи се MGIT Growth Supplement и мешавина PANTA антибактеријских лекова.

Раст микроорганизама се региструје оптички. Заснован је на флуоресценцији, која се јавља када микобактерије троше кисеоник током свог раста. Кисеонично зависна флуорохромна боја налази се на дну посебне епрувете и прекривена је слојем силикона. Размножавање микобактерија доводи до смањења количине кисеоника у епрувети и смањења његове концентрације, што узрокује повећање флуоресценције, која постаје видљива када се епрувета озрачи ултраљубичастим светлом и аутоматски се региструје фотосензорима уграђеним у уређај VASTES-960. Интензитет луминесценције се региструје у јединицама раста (GU). Подаци о расту се аутоматски уносе у рачунар, где се могу сачувати. Рачунарска анализа кривих раста може пружити информације о присуству различитих базена микобактерија, укључујући и нетуберкулозне, а такође помаже у процени својстава раста микобактерија.

Као резултат увођења таквих система, време раста микобактерија је значајно смањено, у просеку 11 дана на VASTEC-960 и 19 дана на MB/Bact наспрам 33 дана на стандардној густој хранљивој подлози. Треба напоменути да ови системи захтевају висококвалификовано особље. Сетва материјала на течне подлоге нужно је праћена сетвом на Ловенштајн-Јенсенову подлогу, која игра улогу резервне у случајевима када микобактерије туберкулозе не расту на другим подлогама.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Одређивање осетљивости микобактерија на лекове

Одређивање спектра и степена осетљивости микобактерија на антитуберкулозне лекове је од великог клиничког значаја, као и за епидемиолошку процену ширења туберкулозе резистентне на лекове. Поред тога, праћење резистенције на лекове нам омогућава да проценимо ефикасност антитуберкулозног програма у целини, чинећи га интегралним показатељем рада свих компоненти антитуберкулозних мера.

Учесталост и време тестирања осетљивости на лекове:

• пре почетка лечења, једном да би се утврдила стратегија и тактика лечења:
• Приликом изоловања култура из различитих материјала од пацијента (спутум, БАЛ, урин, ексудати, цереброспинална течност итд.), сви изоловани сојеви се испитују:
• на крају интензивне фазе лечења у одсуству клиничке и радиолошке динамике:
• ако је потребно променити режим лечења у случају:
  • одсуство негативности спутума;
  • рекултура након негативности спутума;
  • нагло повећање количине АБК у брису након почетног смањења. Добро је познато да се из материјала пацијента са туберкулозом изолују сојеви Mycobacterium tuberculosis са различитом осетљивошћу на лекове. Осетљивост сојева на антитуберкулозне лекове може се разликовати у спектру лекова, степену, учесталости и брзини развоја резистенције.

Степен резистенције Mycobacterium tuberculosis на лекове одређује се у складу са утврђеним критеријумима, који су усмерени на клинички значај резистенције и зависе од антитуберкулозне активности лека, његове фармакокинетике, концентрације у лезији, максималне терапијске дозе итд.

Одређивање осетљивости микобактерија на лекове тренутно се врши микробиолошким методама:

• апсолутне концентрације (метод разблаживања на чврстим или течним хранљивим медијумима),
• пропорције,
• коефицијент отпора.

Обично се отпорност манифестује у облику визуелно посматраног раста колонија микобактерија туберкулозе, међутим, постоје методе које индукују раст у раним фазама деобе ћелија микобактерија у облику реакција у боји. Ове методе скраћују време тестирања са 3-4 на 2 недеље.

Метода апсолутне концентрације коју препоручује Комитет за хемотерапију СЗО постала је широко распрострањена у Русији као јединствена метода. Са методолошке тачке гледишта, она је најједноставнија, али захтева високу стандардизацију и прецизност лабораторијских поступака. Тест осетљивости на лекове састоји се од сета епрувета са хранљивом подлогом модификованом антитуберкулозним лековима. Сет се састоји од 2-3 епрувете са различитим концентрацијама сваког од коришћених лекова, једне контролне епрувете са подлогом без лека и једне епрувете која садржи 1000 μг/мл натријум салицилата или 500 μг/мл паранитробензоеве киселине за детекцију раста нетуберкулозних микобактерија.

За припрему сета медијума са препаратима користи се модификовани Ловенштајн-Јенсенов медијум (без скроба), који се сипа у бочице. У сваку од бочица додаје се одређена запремина одговарајућег разблажења антитуберкулозног лека. Садржај бочица се темељно меша, сипа у епрувете и коагулира у нагнутом положају 40 минута на температури од 85°C. Препоручује се коагулација медијума у електричном коагулатору са аутоматском контролом температуре. Медијум са антитуберкулозним лековима

1. ред се може чувати у фрижидеру на 2-4 °C током 1 месеца, са лековима 2. реда - не дуже од 2 недеље. Чување медијума са лековима на собној температури је неприхватљиво. Приликом припреме раствора антитуберкулозних лекова, узима се у обзир њихова активност, израчунавајући концентрацију са корекцијом за молекулску тежину неспецифичног дела лека, чистоћу итд. За одређивање осетљивости на лекове користе се само хемијски чисте супстанце.

Принцип методе је одређивање концентрације антитуберкулозног лека која сузбија раст значајног дела популације микобактерија. Када се правилно изведе, ова метода има добру поузданост.

Пре извођења теста, потребно је уверити се да изолована култура Mycobacterium tuberculosis не садржи страну микрофлору. Хомогена суспензија која садржи 500 милиона микробних тела у 1 ml (оптички стандард замућености 5 јединица) припрема се из културе микобактерија у 0,9% раствору натријум хлорида. Добијена суспензија се разблажи са 0,9% раствором натријум хлорида (1:10) и 0,2 ml суспензије се додаје у сваку епрувету комплета хранљивих подлога. Инокулиране епрувете се стављају у термостат на 37 °C и држе хоризонтално 2-3 дана тако да се коса површина хранљиве подлоге равномерно инокулира суспензијом Mycobacterium tuberculosis. Затим се епрувете померају у вертикални положај и инкубирају 3-4 недеље. Резултати се бележе након 3-4 недеље.

Пошто је време потребно за изоловање патогена из клиничког материјала на хранљивим медијумима најмање 1-1,5 месеци, резултати одређивања осетљивости на лекове овом методом могу се добити најраније 2-2,5 месеца након сетве материјала. Ово је један од главних недостатака методе.

Резултати испитивања осетљивости микобактерија на лекове тумаче се на основу одређених критеријума. На чврстим подлогама, култура се сматра осетљивом на концентрацију лека садржаног у подлози ако број микобактеријских колонија узгајаних на датој епрувети са леком не прелази 20 са обилним растом на контролној епрувети без лекова. Само ако има више од 20 колонија, култура се сматра отпорном на дату концентрацију. У пракси, када се добију резултати раста у епруветама близу 20 CFU, потребно је обавестити клиничку јединицу да је осетљивост или отпорност у овом случају гранична, јер то понекад може објаснити нејасну динамику клиничких индикатора.

За различите препарате утврђује се одређена концентрација при којој се примећује репродукција критичног дела микобактеријске популације. Ове концентрације се називају „критичне“. Величина раста микобактеријске популације на хранљивој подлози са препаратом у критичној концентрацији користи се као критеријум за стабилност.

У домаћој фтизиолошкој пракси, приликом одређивања резистенције на лекове, нису ограничени само на одређивање критичних концентрација. То је због чињенице да проширена дефиниција нивоа резистенције патогена на лекове омогућава клиничару да правилније формулише тактику хемотерапије, користећи знање о потентирајућем дејству комбинација лекова, да предвиди унакрсну резистенцију или да користи ефикасније лекове коришћене групе антитуберкулозних лекова.

Метода апсолутне концентрације је најједноставнија, али и најосетљивија на грешке направљене у њеној примени. Поузданија, посебно приликом одређивања осетљивости на лекове друге линије, и широко распрострањена ван Русије је пропорционална метода. Она узима у обзир недостатке методе апсолутне концентрације, али је њена примена радно интензивнија.

Метода је веома слична методи апсолутне концентрације. Припрема епрувета са лековима је иста као код методе апсолутне концентрације. Међутим, доза засејавања суспензије микобактерија туберкулозе је смањена за 10 пута, што елиминише учесталост спонтане резистенције неких сојева микобактерија туберкулозе на лекове као што су Етамбутол, Протионамид, Капреомицин. Као контроле користе се 2 или 3 епрувете са дозом засејавања једнаком оној у епруветама, сукцесивно разблажене 10 и 100 пута. Критеријум за резистенцију је удео визуелно посматраног раста микобактерија туберкулозе. За лекове 1. линије, критеријум за резистенцију је вишак раста од 1% почетне популације, за лекове 2. линије - раст од 1 или више од 10% почетног, у зависности од изабране критичне концентрације.

Године 1997, радна група СЗО и Међународне уније против туберкулозе за откривање резистенције на лекове против туберкулозе извршила је прилагођавања ових критеријума, предлажући да се микобактерије које расту на густој подлози за јаја Ловенштајн-Јенсена при следећим концентрацијама сматрају резистентним:

• дихидрострептомицин - 4 μг/мл;
• изониазид - 0,2 µг/мл:
• рифампицин - 40 мцг/мл:
• Етамбутол - 2 мцг/мл.

Године 2001, предложене су критичне концентрације за следеће лекове друге линије (за критични удео од 1%):

• капреомицин - 40 мцг/мл;
• протионамид - 40 мцг/мл;
• канамицин - 30 μг/мл;
• виомицин - 30 μг/мл;
• циклосерин - 40 мцг/мл;
• аминосалицилна киселина - 0,5 мцг/мл;
• офлоксацин - 2 мцг/мл.

Резултати раста се процењују након 4 недеље као прелиминарни и након 6 недеља култивације као коначни.

За одређивање осетљивости на лекове на пиразинамид, који се широко користи у савременој хемотерапији туберкулозе, препоручена критична концентрација је 200 μг/мл. Међутим, још увек не постоји општеприхваћена метода за одређивање резистенције на овај лек на чврстим хранљивим медијумима, пошто се његова антибактеријска активност манифестује само у киселој средини (pH <6), што је технички тешко одржавати. Поред тога, многе клиничке културе Mycobacterium tuberculosis нерадо расту на јајним медијумима са киселом средином.

Ради процене квалитета резултата одређивања осетљивости микобактерија на лекове, препоручује се контрола сваке нове серије Ловенштајн-Јенсенове подлоге паралелним одређивањем осетљивости стандардног музејског соја H37Rv. Поред тога, постоје одређени микробиолошки критеријуми који морају бити испуњени како би методе дале добро репродуцибилан и правилно интерпретиран резултат. То укључује виталност културе микобактерија туберкулозе, правила за добијање хомогене суспензије и суспензије, правила за одабир култура микобактерија туберкулозе и репрезентативност одабране бактеријске масе. Поузданост одређивања резистенције на лекове опада са изузетно лошим излучивањем бактерија.

Недавно је метод одређивања осетљивости на лекове коришћењем аутоматизованих система препознат као перспективан. Најнапреднији у овој области су развоји засновани на VASTEC MGIT-960. У овом случају, осетљивост микобактерија туберкулозе на лекове одређује се на основу модификоване пропорционалне методе. Током одређивања, упоређује се брзина раста микобактерија туберкулозе у контролној епрувети и у епруветама са лековима. За одређивање осетљивости на стрептомицин, изониазид, рифампицин и етамбутол користе се обогаћујући адитиви и антибиотици који су укључени у SIRE комплет. За одређивање осетљивости на пиразинамид користи се PZA комплет. Током теста, епрувете са лековима се инокулирају суспензијом микобактерија туберкулозе, као и контролне епрувете са 100-струким разблажењем суспензије за све лекове, са изузетком пиразинамида, где је разблажење суспензије 10 пута. Критеријум за стабилност је индикатор раста микобактерија од 100 GU када раст у контролној епрувети достигне 400 GU (видети „Културолошке методе за изоловање микобактерија“). Резултати се бележе и тумаче аутоматски и подешавају се унетим или изабраним програмом.

Коначне концентрације у епрувети са течном хранљивом подлогом користе се као критичне концентрације. Тренутно су развијене критичне концентрације и за лекове прве линије и за неке лекове друге линије. Треба напоменути да се одређивање осетљивости микобактерија туберкулозе на циклосерин и аминосалицилну киселину врши само на хранљивим подлогама на бази јаја.

Детаљан протокол за рад са описаним системом омогућава тестирање осетљивости на лекове како на изолованој култури (са густом хранљивом подлогом), тако и коришћењем примарног раста микобактерија у MGIT епрувети. Последња опција значајно смањује време потребно за спровођење студија културе, омогућавајући да се комплетни резултати културе микобактерија туберкулозе (укључујући информације о осетљивости на лекове) добију у року од 3 недеље од сакупљања материјала, док традиционална метода то може да обезбеди тек до 3. месеца. Благовремени резултати, када је пацијент у интензивној фази лечења, могу да надокнаде релативно високе трошкове студија.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Диференцијација микобактерија

С обзиром на то да хранљиве подлоге које се користе нису строго селективне, накнадна диференцијација изолованих микобактерија сматра се обавезном. Потреба за диференцијацијом микобактерија је последица низа карактеристика патолошких процеса које изазивају представници рода: различит ток и исход туберкулозе и микобактериозе, присуство природне резистенције на неке антитуберкулозне лекове.

Препознато је да се примарна идентификација микобактерија комплекса M. tuberculosis од нетуберкулозних микобактерија спроводи према следећим карактеристикама: брзина раста на густим хранљивим медијумима, формирање пигмената, морфологија колонија, присуство отпорности на киселине и температурни оптимум за раст.

Нажалост, не постоји јединствена лабораторијска метода која може поуздано да разликује микобактерије комплекса M. tuberculosis од других микобактерија отпорних на киселину; међутим, комбинација горе описаних знакова са резултатима низа биохемијских тестова датих у наставку омогућава идентификацију микобактерија комплекса M. tuberculosis са вероватноћом до 95%.

Да би се разликовале микобактерије комплекса M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii и друге) од споро растућих нетуберкулозних микобактерија, користе се основни биохемијски тестови за откривање присуства следећих знакова:

• способност производње никотинске киселине (тест ниацина):
• активност нитрат редуктазе;
• термостабилна каталаза;
• раст на медијуму са натријум салицилатом (1 мг/мл).

Као додатни тест, могу се користити и тестови раста на медијуму који садржи 500 μг/мл пара-нитробензоеве киселине или 5% натријум хлорида.

Многе бактериолошке лабораторије идентификују ове микроорганизме само на комплексном нивоу, што је због ограничених могућности лабораторија и методолошких могућности специјалиста.

У већини случајева у пракси, следећи тестови су довољни за разликовање M. tuberculosis и M. bovis: ниацин, нитрат редуктаза, пиразинамидаза и регистрација раста на медијуму који садржи 2 μг/мл тиофен-2-карбоксилне киселине хидразида. Узима се у обзир да се микобактерије комплекса M. tuberculosis карактеришу следећим скупом карактеристика:

• спор раст (више од 3 недеље);
• температура раста унутар 35-37 ^° C;
• одсуство пигментације (боја слоноваче);
• изражена обојеност отпорна на киселине;
• позитиван тест на ниацин;
• позитиван тест нитрат редуктазе;
• одсуство термостабилне каталазе (68 ^o C).
• недостатак раста на Ловенштајн-Јенсен подлози која садржи:
  • 1000 µг/мл натријум салицилне киселине,
  • 500 мцг/мл пара-нитробензоеве киселине,
  • 5% натријум хлорид:
• раст у присуству 1-5 μг/мл тиофен-2-карбоксилне киселине.

Релевантност диференцијације изолованих микобактерија значајно ће се повећати са растом учесталости регистрације случајева ХИВ/АИДС-а повезаних са туберкулозом или микобактериозом. Тренутно не постоји апсолутна сигурност у спремност практичних регионалних лабораторија да правилно обаве овај обим посла.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Имунолошка дијагностика туберкулозе

Постоји низ универзалних феномена, препарата и имунолошких тестова који су првобитно откривени специфично код туберкулозе или у моделу имуног одговора на микобактерије. То укључује БЦГ и туберкулин, феномен као што је кожни ДСТ (туберкулински тестови - Пиркеова и Мантуова реакција), реакцију на поткожну примену туберкулина сензибилизованим животињама (Кохов феномен). Нека од првих антитела код заразних болести такође су откривена код туберкулозе. Наравно, што је дубље разумевање механизама антитуберкулозног имунитета и њихове генетске контроле, то је шира употреба имунолошких метода и препарата који утичу на имунитет за решавање практичних проблема фтизиологије.

Најважнијим и најсложенијим практичним проблемом у овом тренутку сматра се откривање туберкулозе у процесу масовног скрининга становништва. Међутим, упркос бројним извештајима о „успесима“ (на ограниченом материјалу), не постоји имунолошка метода (репродуцибилна у „било којим рукама“) или лек погодан за ове сврхе.

Имунолошке методе, посебно серолошке студије (одређивање антигена, антитела) и туберкулински провокациони тестови, широко се користе у клиничкој пракси.

Серолошке методе, које одређују антигене и антитела у различитим срединама тела, налазе се на првом месту међу имунолошким студијама које се користе у диференцијалној дијагностици.

Специфичност одређивања антитела на микобактерије туберкулозе зависи од антигена који се користе у имунолошкој анализи. Предложен је значајан број антигена, од којих је први туберкулин ППД:

• ППД и други сложени препарати из течности за култивацију;
• ултразвучни дезинтегратор;
• Тритонов екстракт и други сложени препарати ћелијског зида;
• 5-антиген (Данијел);
• 60-антиген (Кокито);
• липоарабиноманан;
• фактор врпце (трехалоза-6,6-ди-миколат);
• фенолни и други гликолипиди;
• липополисахариди;
• антиген који везује фибронектин;
• протеини (најчешће рекомбинантни); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA, итд.

Као резултат дугогодишњих истраживања руских и страних научника, идентификовани су главни обрасци формирања антитела и ефикасност серолошке дијагностике туберкулозе: што је антиген сложенији, то је већа осетљивост и нижа специфичност тестова. Специфичност варира у различитим земљама у зависности од инфекције популације са M. tuberculosis и нетуберкулозним микобактеријама, од БЦГ вакцинације итд. Код деце је информативност серодијагностике нижа него код одраслих. Код примарне туберкулозе (чешће код деце), одређивање IgM је информативније; код секундарне туберкулозе - IgG. Код ХИВ-инфицираних особа, информативност серодијагностике у одређивању антитела је смањена. Ефикасност одређивања антитела зависи од низа „клиничких момената“: активности процеса (присуство или одсуство „изолације“ микобактерија, присуство каријесних шупљина, степен инфилтрације), распрострањености процеса, трајања његовог тока.

Осетљивост методе ензимског имунотестирања (ЕИА) је око 70%. Недовољна ефикасност студије је последица њене ниске специфичности. Претходно су разматране могућности коришћења серолошког скрининга код група високог ризика, посебно међу људима са посттуберкулозним променама на плућима.

Да би се повећала специфичност ELISA теста, траже се специфичнији антигени, укључујући и оне добијене генетским инжењерингом: ESAT-6, итд. (видети горе). Употреба строго специфичних антигена (38 kDa, ESAT) повећава специфичност, али значајно смањује осетљивост анализе. Уз ELISA (експериментални лабораторијски тест системи, као што је Pathozyme ELISA комплет), нуде се и имунохроматографски комплети са латералном филтрацијом (Mycodot), као и други слични тестови (мембранска тачкаста анализа) са визуелном проценом резултата теста. Приликом спровођења ових тестова, анализа траје 10-30 минута; не захтевају посебну опрему, захтевају визуелну процену резултата, што је повезано са извесном субјективношћу. Ове методе имају приближно исте карактеристике осетљивости и специфичности (70% и 90-93%, респективно) као традиционални ELISA тест.

Употреба метода имунолошке анализе има одређену вредност као додатна метода која се узима у обзир у комплексу метода које се користе у диференцијалној дијагнози туберкулозе, посебно у дијагнози њених екстрапулмоналних облика. ELISA метода је најефикаснија у дијагнози туберкулозног менингитиса приликом испитивања цереброспиналне течности. У овом случају, осетљивост анализе је 80-85%, а специфичност 97-98%. Постоје информације о ефикасности одређивања антитела на Mycobacterium tuberculosis у сузној течности у дијагнози туберкулозног увеитиса.

Индукција синтезе гама интерферона in vitro

Гама интерферон (IFN-γ) је фактор специфичне имунолошке заштите, који се остварује активацијом ензимских система макрофага. Индукција синтезе IFN-γ од стране сензибилизованих Т-лимфоцита узрокована је њиховом интеракцијом са микобактеријским антигенима.

Као антигени користе се и туберкулински ППД и специфични антигени добијени генетским инжењерингом, посебно ЕСАТ-6 антиген (рано секретовани антиген са молекулском тежином од 6 kDa) и ЦФП-10 (протеин филтрата културе, 10 kDa). Генетски модификовани или рекомбинантни антигени су одсутни у ћелијама БЦГ вакцине и других микобактерија. Приликом употребе туберкулина, резултати IFN-γ индукционог теста су упоредиви са резултатима туберкулинског кожног теста (директна корелација). Приликом употребе генетски модификованих антигена, резултати теста су специфичнији и не зависе од претходне БЦГ вакцинације. Приликом испитивања вакцинисаних особа које нису имале контакт са туберкулозном инфекцијом, специфичност теста је 99%. Осетљивост теста међу пацијентима са туберкулозом креће се од 81 до 89%.

Развијени су тестови и дијагностика засновани на краткорочној култивацији ћелија целе крви или мононуклеарних ћелија изолованих из крви са антигенима микобактерија туберкулозе in vitro, након чега следи одређивање концентрације IFN-γ или бројање броја Т-лимфоцита који синтетишу IFN-γ. Концентрација интерферона синтетисаног у епрувети одређује се ELISA методом коришћењем моноклонских антитела која везују IFN-γ. Затим се, коришћењем калибрације стандардног IFN-γ, одређује његова концентрација у епрувети или јажицама плоче.

У Елиспот тесту, број Т ћелија које синтетишу IFN-γ се броји на површини посуде обложене антителима на IFN-γ.

Произвођачи ин витро IFN-γ индукционе дијагностике, коју је одобрила Америчка агенција за храну и лекове (FDA), тврде да тест не може да разликује латентну туберкулозну инфекцију од активне туберкулозе. Стога, у регионима са високом стопом инфекције, тест нема директну дијагностичку вредност. Међутим, у нашој земљи се може користити за разликовање туберкулозне инфекције код деце од алергије након вакцинације, као и за процену нивоа специфичног имунитета током лечења.

Тренутно се проучава домаћи тест систем за одређивање индукције синтезе IFN-γ специфичним туберкулозним антигенима in vitro.

Имуни статус и ток туберкулозе, имунокорекција

Током лечења туберкулозе, код људи се јављају промене у антигенемији и стању имуног система.

Подаци о променама у ексудатима и ткивима су углавном контрадикторни. Једино што се може приметити са пуним оправдањем јесте да туберкулозни грануломи, по правилу, садрже значајан број активираних Т-лимфоцита.

Има смисла да се задржимо на још две тачке које су неопходне за разумевање улоге имунолошких механизама у лечењу туберкулозе код људи:

• Пацијенти са СИДОМ имају посебно високу учесталост развоја вишеструке резистенције на лекове;
• У случају вишеструке резистенције на лекове (и у одсуству ХИВ инфекције), имуни поремећаји (првенствено Т-ћелијски имунитет) су посебно значајни.

Код туберкулозе се широко користе различите методе имунокорекције: пре свега, то су лекови који делују углавном на Т-ћелијски имунитет и мононуклеарни фагоцитни систем (тимусни хормони, изофон, ликопид, полиоксидонијум, итд.), као и целе (атенуиране) микобактерије и њихове компоненте.

Молекуларно-биолошка дијагностика туберкулозе

Методе молекуларне биологије у дијагностици заразних болести углавном обухватају методе засноване на манипулацији геномским материјалима бактеријских и вирусних патогена у циљу идентификације специфичног генетског материјала - делова ДНК са нуклеотидном секвенцом специфичном за дату врсту или сој патогена, за анализу специфичних секвенци ДНК у генима који одређују осетљивост патогена на одређене лекове, као и за анализу функционалне активности одређених гена патогена. Молекуларно-биолошке методе су постале широко распрострањене у научним истраживањима и практичној примени у дијагностици и праћењу различитих бактеријских и вирусних инфекција након открића полимеразне ланчане реакције 1985. године од стране Кери Малис (добитнице Нобелове награде. 1989).

Принципи и могућности методе полимеразне ланчане реакције

ПЦР омогућава амплификацију (умножавање) нуклеотидне секвенце (фрагмента ДНК патогена) у епрувети за неколико сати милион пута. Спровођење реакције у присуству појединачних ланаца ДНК одређује изузетно високу осетљивост анализе.

Нуклеотидни низ одређених делова ДНК ланца одређује генетску јединственост микроорганизма, што објашњава високу специфичност ПЦР-а.

Значај ове методе за откривање и проучавање карактеристика Mycobacterium tuberculosis је због биолошких карактеристика микроорганизма, који има веома спор раст: време удвостручавања ДНК Mycobacterium tuberculosis током њихове култивације је 12-24 сата.

Принцип ПЦР методе је амплификација - вишеструко, милион пута умножавање делова специфичне ДНК секвенце у микрозапремини епрувете са цикличним понављањем следеће три реакционе фазе, од којих се свака одвија у различитом температурном режиму:

• Фаза I - денатурација дволанчане ДНК при загревању са дивергенцијом њених ланаца;
• Фаза II - комплементарно везивање (хибридизација) прајмера (прајминг олигонуклеотида) са крајњим деловима ланаца строго специфичног фрагмента ДНК одабраног за амплификацију;
• Фаза III – завршетак ланца фрагмента ДНК помоћу термостабилне ДНК полимеразе.

За амплификацију, епрувета мора да садржи молекуле матричне ДНК. Четири врсте дезоксинуклеозидних трифосфата (нуклеотида) који садрже одговарајуће азотне базе: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц); вештачки синтетизовани прајмерски олигонуклеотиди (прајмери) који се састоје од 18-20 парова база; термостабилни ензим, ДНК полимераза, са температурним оптимумом од 68-72 ^° C, и јоне магнезијума.

Специфичност ПЦР зависи од избора ДНК фрагмента. У складу са њим, синтетишу се фланкирајући прајмерни олигонуклеотиди. Специфичност хибридизације и комплетирања ДНК ланца одређена је принципом комплементарности следећих парова азотних база: аденин-тимин, гванин-цитозин.

За одређивање генома микобактерија туберкулозног комплекса, најефикаснија мета амплификације у већини тест система је ДНК фрагмент IS6110, који код већине сојева микобактерија туберкулозе има значајан број (10-20) понављања у геному, што обезбеђује, уз специфичност, и високу осетљивост анализе. Истовремено, описани су сојеви микобактерија туберкулозе са малим бројем понављања или одсуством фрагмента IS6110.

Екстракција молекула ДНК из биолошког узорка

Да би се извршила ПЦР, молекули ДНК патогена морају бити изоловани из биолошког материјала у минималној запремини, са минималном количином неспецифичне ДНК и различитих инхибитора ензима - ДНК полимеразе.

Припрема узорака мора се спроводити под условима који спречавају унакрсну контаминацију узорака који се проучавају изолованим молекулима ДНК. То захтева претходну обраду просторије ултраљубичастим светлом, подова и радних површина столова и уређаја - растворима који садрже хлор. Такође је потребно користити чисте рукавице, епрувете за једнократну употребу и врхове за аутоматске пипете.

Да би се изоловала ДНК Mycobacterium tuberculosis из клиничких узорака (цереброспинална течност, бронхијални лаваж) који не садрже велики број леукоцита, ћелијског остатка или соли, довољно је центрифугирати узорак на 3-4 хиљаде обртаја у минути, додати 20-30 µl 2% раствора Triton X-100 у седимент и загрејати на 90 ^° C током 30 минута.

Припрема узорка спутума захтева ефикасно разблаживање, обично коришћењем 4% натријум хидроксида и N-ацетил-L-цистеина (NALC) у количини од 50-80 мг по узорку, у зависности од вискозности узорка. Раствор NALC-а треба припремити ex tempore, или се NALC прах може додати сув директно у узорак. Након разблаживања, узорке треба центрифугирати 15 минута на 3.500-4.000 о/мин (3.000 g) у епруветама са затварачем на завртање од 50 ml, тј. под истим условима који се препоручују за припрему спутума пре културе.

За екстракцију ДНК из седимента најчешће се користи метода заснована на употреби 5-6 моларног раствора гванидин изотиоцијаната као лизирајућег реагенса и микропорозних честица силицијум оксида („дијатомејска земља“) које сорбују молекуле ДНК. Неспецифичне супстанце, укључујући могуће инхибиторе, затим се испирају у 2,5 моларном раствору гванидин изотиоцијаната и раствору етанола, након чега се молекули ДНК десорбују у води, а ови узорци се користе за извођење ПЦР-а. Ради поједностављења технологије екстракције ДНК, „дијатомејска земља“ се често замењује магнетним микрочестицама обложеним силицијум оксидом. У овом случају, уместо центрифугирања, користи се посебан магнетни сталак за микроепрувете за таложење честица.

У Русији је развијена оригинална метода имуномагнетне сепарације микобактерија са накнадном екстракцијом ДНК патогена. За имуномагнетну сепарацију микобактерија туберкулозе користе се ферочестице величине 3-5 μm, обложене силицијум оксидом, на које су хемијском везом везана поликлонална (зечја) антитела на микобактерије туберкулозе. Узорци спутума након алкалне лизе неутралишу се киселим раствором Tris-HCl и инкубирају са имуномагнетним сорбентом. Затим се имуноферочестице сакупљају помоћу магнетног штапића са заменљивим врхом, преносе у микроепрувету и таложе. Додаје се 20-30 μl 2% раствора Triton X-100 и загрева 30 минута на 90 ^o C. Супернатант се користи као ДНК матрица за PCR анализу.

Тежак проблем је екстракција ДНК микобактерије туберкулозе из узорака биопсије. За лизу биопсије, ензим протеиназа К се користи у коначној концентрацији од 200-500 мг/л на температури од 56 ^° C преко ноћи. Затим се екстрахује једном од познатих метода. Вишак неспецифичне ДНК у PCR анализи узорака биопсије често изазива инхибицију реакције, што захтева поновљену екстракцију ДНК.

Методе за откривање резултата

Након завршетка реакције, амплификовани фрагменти ДНК патогена се идентификују коришћењем различитих метода.

Метода гел електрофорезе је добро позната. У овом случају, добијени фрагмент ДНК се идентификује позитивном контролом која садржи жељени специфични фрагмент ДНК, или претходно познатом величином (бројем парова нуклеотида) фрагмента, која се одређује помоћу стандардног молекуларног маркера.

У присуству специфичне боје - етидијум бромида, која је укључена у дволанчану ДНК, синтетизовани фрагмент ДНК се открива као трака која светли под утицајем ултраљубичастог светла.

Величина фрагмента ДНК, одређена електрофорезом на основу пређене удаљености од почетка, мора одговарати познатом маркеру молекулске тежине или позитивној контроли.

Друге методе за одређивање резултата ПЦР-а заснивају се на хибридизацији једноланчаних ПЦР производа са комплементарним олигонуклеотидом - ДНК сондом обележеном биотином, након чега следи детекција помоћу ензимске реакције, на пример, везивањем коњугата стрептавидин-алкална фосфатаза за биотин.

На основу ове врсте детекције, креирани су PCR анализатори у којима се детекција PCR резултата врши аутоматски као резултат очитавања оптичке густине у узорцима након што је дошло до ензимске реакције.

Недостаци ових метода укључују могућност интралабораторијске контаминације прилично кратким фрагментима молекула ДНК. Када ови молекули уђу у новотестиранe узорке, они постају матрица за ПЦР и доводе до лажно позитивних резултата.

У том смислу, како би се спречили лажно позитивни резултати, уводе се строга правила за одвајање и изоловање просторија: за екстракцију ДНК из биолошких узорака; просторија за детекцију резултата (електрофореза) од чисте зоне. Ове просторије представљају зону вероватне контаминације. Још једна изолована зона је чиста просторија за уношење узорака ДНК који се испитују у епрувете са реакционом смесом за ПЦР. И коначно, претпоставља се да главни уређај - ДНК појачивач - треба изнети у посебну, могуће канцеларијску, просторију.

Да би се спречила контаминација производима претходних реакција - ампликонима, неки PCR тест системи садрже дезоксинуклеозид уридин уместо дезоксинуклеозид тимидина, који се уграђује у одговарајућу позицију током in vitro синтезе ланца, односно азотна база тимин присутна у нативној ДНК замењује се урацилом. Урацил ДНК гликозилазе додате у реакциону смешу анализираног материјала уништава само контаминирајуће фрагменте дезоксиуридином, али не и нативну анализирану ДНК која садржи дезокситимидин. Накнадно загревање на 94 ^o C инактивира овај ензим и не омета амплификацију у PCR.

Постоји тест систем заснован на изотермалној амплификацији рРНК, за који се прво врши реверзна транскрипција и синтеза молекула ДНК, који заузврат представљају матрицу за накнадну синтезу молекула РНК. Ампликони РНК се детектују помоћу ДНК сонде обојене акридином током хибридизације у раствору реакционе епрувете. Ова метода, поред високе осетљивости, има предност спровођења анализе у једној епрувети, што спречава контаминацију. Према ауторима, осетљивост ове методе у респираторним узорцима достиже 90% са специфичношћу од 99-100%.

Нове методе детекције се имплементирају у PCR-у у реалном времену. Ове методе се разликују првенствено по томе што се PCR и детекција његових резултата спроводе истовремено у једној затвореној епрувети. Ово не само да технолошки поједностављује метод анализе, већ и спречава контаминацију лабораторијских просторија и узорака производима претходног PCR-а.

У PCR-у у реалном времену, резултати се детектују флуоресценцијом која настаје хибридизацијом флуорогене ДНК сонде са специфичним фрагментом ДНК амплификованим током PCR-а. Структура флуорогених ДНК сонди је конструисана на такав начин да се флуоресцентни маркер ослобађа као резултат ензимске реакције или се дистанцира од молекула гашења флуоресценције тек након специфичне хибридизације са жељеним молекулом ДНК амплификованим током PCR-а. Како се број молекула хибридизованих са сондом повећава, повећање флуоресценције до детектабилног нивоа је пропорционално броју молекула амплификованог производа. Пошто се број молекула фрагмената ДНК удвостручује током сваког PCR циклуса, број циклуса из којег се детектује и повећава флуоресценција је обрнуто пропорционалан броју молекула ДНК у оригиналном узорку. Ако се у реакцију уведе неколико различитих познатих концентрација молекула одговарајућег фрагмента ДНК микобактерије туберкулозе као калибратор, тада се број ДНК генома у материјалу који се испитује може израчунати помоћу рачунарског програма.

Сваки стандардни узорак се дуплира. Квантитативни критеријум је минимални број ПЦР циклуса потребан за појаву и раст детектабилне флуоресценције. Апсцисна оса је број циклуса; ординатна оса је вредност флуоресценције. Концентрације ДНК су обрнуто пропорционалне броју циклуса потребних за појаву флуоресценције. Прозори у десној колони (21-32) приказују бројеве циклуса за одговарајуће концентрације. Разлике између 10-струких концентрација ДНК фрагмената 10² ^- 10⁶ ^мл су 3,2-3,4 циклуса. За два пацијента, концентрације IS6110 фрагмената биле су око 10³ ^/ мл и ^10⁴ /мл. Узимајући у обзир број понављања (6-20) анализираних фрагмената у геному Mycobacterium tuberculosis, број Mycobacterium tuberculosis у клиничким узорцима је око 100 и 1000 ћелија, респективно.

Примена ПЦР-а у дијагнози туберкулозе

ПЦР метода се у највећој мери користи за брзу дијагнозу туберкулозе - детекцију Mycobacterium tuberculosis у клиничким узорцима: спутуму, бронхијалним испирањима, плеуралном ексудату, урину, цереброспиналној течности, пунктури остеолизе, аспиратима женског гениталног тракта и разним биопсијама. У студији спроведеној у Холандији на око 500 узорака спутума и бронхијалних испира од 340 пацијената са потврђеном дијагнозом плућне туберкулозе, проучавана је упоредна осетљивост ПЦР, методе културе и микроскопије бриса. Осетљивост анализе била је 92,6, 88,9 и 52,4%, респективно. Специфичност свих метода била је око 99%.

Извршено је поређење ефикасности детекције Mycobacterium tuberculosis коришћењем микроскопије размаза, сетве на Ловенштајн-Јенсенову подлогу, VASTES тест система и PCR анализе. PCR је показао осетљивост од 74,4%, микроскопија - 33,8%, сетва на чврсту подлогу - 48,9% и VASTES - 55,8%. Просечно време детекције за сетву на Ловенштајн-Јенсенову подлогу је 24 дана. VASTES - 13 дана, PCR - 1 дан.

Такође се разматра потенцијал коришћења ПЦР-а као осетљиве и брзе методе за праћење ефикасности лечења туберкулозе.

Детекција ДНК Mycobacterium tuberculosis PCR методом уз ефикасну хемотерапију утврђује се током дужег временског периода - у просеку 1,7 месеци у поређењу са бактеријским излучивањем утврђеним флуоресцентном микроскопијом, и 2,5 месеца у поређењу са бактериолошким прегледом.

Дијагноза екстрапулмоналних облика туберкулозе

Значај ПЦР-а као осетљиве методе је посебно велики за екстрапулмоналне облике, јер су управо код ових облика клиничке и радиолошке методе и традиционалне бактериолошке методе за одређивање Mycobacterium tuberculosis у дијагностичким материјалима неефикасне.

Приликом испитивања узорака урина, резултати PCR анализе били су позитивни код 16 од 17 пацијената са активном туберкулозом уринарног система и негативни код 4 пацијента са неактивном бубрежном туберкулозом и 39 пацијената са нетуберкулозним болестима уринарног система.

Доказана је ефикасност PCR анализе у проучавању аспиратата коштане сржи код пацијената са грозницом непознате генезе са сумњом на туберкулозну природу болести. За дијагнозу туберкулозног лимфаденитиса код деце, проучавана су 102 пункцијска аспирата и узорци биопсије од 67 деце са сумњом на туберкулозни лимфаденитис. Позитивни резултати су добијени: PCR-ом у реалном времену - 71,6%, флуоресцентном микроскопијом - 46,3%, студијом културе - 41,8%. У студији 50 биопсија лимфних чворова код пацијената са болешћу мачјег гребања, сви резултати су били негативни. Дакле, доказана је 100% специфичност PCR анализе. У истом раду, показана је могућност детекције M. avium код пункцијске биопсије лимфних чворова.

Дијагноза женске гениталне туберкулозе код неплодности позната је као један од најтежих дијагностичких проблема. Позитивни резултати добијени су ПЦР студијама биопсија ендометријума, аспирата ендометријума и узорака течности из Дугласове кесице код 14 (56%) од 25 пацијената прегледаних лапароскопски са сумњом на туберкулозу. Микроскопија размаза и студије културе дале су 1 и 2 позитивна резултата, респективно. Ови случајеви су такође били ПЦР-позитивни. Већина ПЦР-позитивних резултата била је у случајевима са карактеристичним одликама туберкулозе према хистолошком прегледу; мањи број је био у случајевима са сумњом на туберкулозу према лапароскопији. Само један позитиван ПЦР резултат добијен је у одсуству лапароскопских података за туберкулозу.

Приликом дијагностиковања екстрапулмоналних облика туберкулозе, клиничари често имају питање о могућности идентификације узрочника приликом испитивања узорака крви PCR методом. Подаци из литературе указују да је детекција ДНК Mycobacterium tuberculosis из узорака крви могућа код узнапредовалих облика HIV инфекције. ДНК Mycobacterium tuberculosis је детектована само код генерализоване туберкулозе различитих органа код пацијената са трансплантираним бубрегом и имуносупресијом.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Идентификација врста микобактерија

ПЦР метода може бити прилично ефикасна за брзу идентификацију микобактерија туберкулозног комплекса и неких врста нетуберкулозних микобактерија након добијања њиховог примарног раста. У овом случају, употреба ПЦР-а може уштедети 7-10 дана потребних за накнадну културну идентификацију позитивног резултата. ПЦР студија је технички веома једноставна, јер не захтева сложену припрему узорка клиничког материјала да би се постигла висока осетљивост. Приликом испитивања 80 позитивних култура у таквом тест систему (MB BacT. компаније Organon), сви позитивни резултати ПЦР анализе били су строго специфични и спроведени су у року од 1 дана. Да би се идентификовале друге врсте микобактерија када се добију у култури, ДНК патогена се хибридизује са специфичним ДНК сондама обележеним акридином, а сојеви се детектују појавом хемилуминисценције помоћу хемилуминометра или на нитроцелулозним тракама са визуелном проценом након хибридизације. Овај комплет идентификује ограничен број врста: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii и M. gordonae.

А. Теленти и др. су такође развили релативно једноставан и јефтин метод за идентификацију врста клинички значајних микобактерија заснован на PCR-у и накнадном третману са два рестрикциона ензима (ензими који имају способност да пресеку молекул ДНК на одређеним тачкама). У овом случају, фрагмент ДНК који кодира протеин топлотног шока (65 kDa) се амплификује, након чега се фрагмент ДНК добијен PCR-ом, величине 439 парова нуклеотида, одвојено третира са два ензима - Bste II и Нае III. Затим, коришћењем електрофорезе на агарозном гелу, анализирају се два добијена производа, одређујући њихове величине (број парова нуклеотида) користећи сет стандардних фрагмената ДНК (молекуларних маркера ДНК) дужине од 100 до 1000 парова нуклеотида. У свакој од дефинисаних врста (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) налазе се 2 или 3 фрагмента ДНК различитих величина за сваки рестрикциони ензим. Комбинација резултујућих фрагмената ДНК различитих величина омогућава да се ове врсте међусобно разликују.

Развија се технологија за биолошке ДНК микрочипове која ће помоћи у идентификацији више од 100 врста микобактерија у једној студији.

Идентификација врста може се такође извршити коришћењем PCR амплификације варијабилног региона 16S рРНК, након чега следи секвенцирање ампликона у поређењу са одговарајућом примарном структуром, што омогућава идентификацију више од 40 врста микобактерија.

ПЦР се такође може користити за идентификацију врста унутар комплекса микобактерија туберкулозе, укључујући диференцијацију између M. bovis и M. bovis BCG. То се ради анализом присуства или одсуства одређених гена у геномским регионима RD1, RD9 и RD10. RD1 је одсутан код M. bovis BCG, али је присутан код вирулентних врста, укључујући M. bovis.

Одређивање осетљивости Mycobacterium tuberculosis на лекове помоћу PCR-а

Задаци молекуларно-генетских метода за одређивање осетљивости или резистенције Mycobacterium tuberculosis на лекове своде се на идентификацију мутација у одређеним нуклеотидним секвенцама познатих гена. Главне методе се заснивају или на директном очитавању (секвенцирању) ових секвенци након амплификације, или на хибридизацији биотином обележених ДНК фрагмената амплификованих током ПЦР са ДНК сондама. Обе опције подразумевају идентификацију супституција у нуклеотидним секвенцама које, при коришћењу ДНК сонди, доводе до одсуства или непотпуне хибридизације на нитроцелулозној мембрани коришћењем ензимског коњугата (стрептавидин-алкална фосфатаза) - LIPA-Rif-TB метода.

Метод мерења флуоресценције у локално фиксираним ДНК сондама на микрорегионима комплементарним познатим мутацијама у PCR-амплификованим генским регионима одговорним за осетљивост или резистенцију на лекове назива се метод микробиочипова. Основни алгоритам за спровођење ове студије је следећи. Након што се ДНК изолује из клиничког узорка или микобактеријске културе, мора се извршити PCR да би се амплификовали одговарајући фрагменти гена groB одговорног за осетљивост на лек на рифампицин, или гени katG и inhA који кодирају микобактеријске протеине одговорне за осетљивост на изониазид. Резултати PCR се процењују помоћу електрофорезе на агарозном гелу, што потврђује пријем одговарајућих фрагмената ДНК жељене дужине. Затим се изводи други круг PCR-а да би се у ДНК увела флуоресцентна ознака. Резултати PCR-а се поново потврђују гел електрофорезом. Након тога, врши се хибридизација (инкубација преко ноћи) са накнадним испирањем добијеног материјала на биочипу, који представља велики број кратких ДНК ланаца (сонди) фиксираних на малој стакленој плочи, комплементарних нуклеотидним секвенцама туберкулозних микобактерија осетљивих на лекове на местима могућих мутација, као и мутантним секвенцама одговорним за резистенцију на лекове. Локација ДНК сонди на плочи је строго дефинисана и утврђује се ниво флуоресценције који се посматра током хибридизације ради одређивања резултата помоћу посебног уређаја за очитавање. У том смислу, резултати анализе се одређују помоћу посебног рачунарског програма.

Последњих година развијене су алтернативне методе за одређивање осетљивости Mycobacterium tuberculosis на лекове засноване на технологији PCR у реалном времену, што омогућава да се ове студије спроведу у режиму затворене епрувете.

Слика 13-13 приказује резултат анализе клиничких култура Mycobacterium tuberculosis у одређивању резистенције на лекове на рифампицин коришћењем PCR-а у реалном времену: 218 - контролни узорак (осетљив на рифампицин); 93 - позитивна контрола за Ser-Trp TCG-TGG мутацију; 4482 - позитивна контрола за Ser-Leu TCG-TTG мутацију; 162-322 - експериментални узорци. Резултат израчунавања кинетичких кривих амплификације за 4 канала: канал 1: 393 - позитивна контрола за Ser-Trp TCG-TGG мутацију; канал 2: 4482 - позитивна контрола за Ser-Leu TCG-TTG мутацију; 162, 163, 172, 295 - експериментални узорци; канал 4: кинетичке криве амплификације свих узорака који учествују у експерименту. Позитивна контрола реакције амплификације. Закључци: Анализа је открила следеће мутације које одређују резистенцију на рифампицин: у узорцима 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Исти принцип је коришћен за одређивање резистенције на лекове на изониазид помоћу гена katG и inhA, који одређују најчешће мутације.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Идентификација соја Mycobacterium tuberculosis

Најпроучаванија метода идентификације сојева Mycobacterium tuberculosis је технологија названа полиморфизам дужине рестрикционих фрагмената (RFLP) и која се заснива на фрагментацији (рестрикцији) ДНК Mycobacterium tuberculosis ензимом Pvu II и накнадној хибридизацији добијених фрагмената са одређеним специфичним секвенцама на ДНК њеног понављајућег елемента IS6110. Интраспецифична варијабилност се остварује због различитог броја понављања IS6110 и њихове локације на ДНК, као и разноликости растојања између одређених тачака напада рестрикционог ензима (рестрикционих места) и елемента IS6110. Ова технологија је веома сложена и захтева много рада. Након третирања ДНК изоловане из културе микобактерија туберкулозе рестрикционим ензимом, врши се гел електрофореза, затим се фрагменти ДНК различитих дужина преносе на нитроцелулозну мембрану, хибридизују се са фрагментима елемента IS6110, а резултати се детектују помоћу ензимске реакције. Добијени специфични образац трака карактерише ДНК специфичног соја микобактерија туберкулозе. Компјутерска анализа открива идентитет или сродство сојева. Упркос чињеници да је РФЛП метода најдискриминаторнија, тј. да открива највећи број разлика код анализираних сојева, она је неефикасна са малим бројем (мање од 5) IS6110 понављања, примећених код неких сојева. Слике 13-14 приказују резултате РФЛП типизације сојева.

Алтернатива може бити метода сполиготипизације - анализа полиморфизма спејсер ДНК секвенци - посредника између директних понављања DR региона. Приликом спровођења сполиготипизације сојева, PCR се спроводи са прајмерима који ограничавају DR регион, након чега се формирају фрагменти различите дужине, који се хибридизују са варијабилним посредним ДНК регионима. Анализа спејсер секвенци DR региона делује, према истраживачима, једноставније, продуктивније и погодније за примарни скрининг сојева и прелиминарну епидемиолошку анализу, као и за директно проучавање клиничког материјала.

Очигледно је да је ефикаснија и технолошки приступачнија метода VNTR (скраћеница од енглеских речи), или метода одређивања варијабилног броја тачних тандемских понављања у ДНК Mycobacterium tuberculosis. Ова метода се заснива само на употреби PCR-а и не захтева додатне манипулације. Пошто је број тандемских понављања код различитих сојева и у различитим локусима различит, фрагменти различитих величина се одређују и анализирају на резултујућем електрофореграму PCR производа. Према речима истраживача, уз помоћ VNTR-а постиже се већи степен дискриминације сојева него код RFLP методе.

Последњих година велика пажња је посвећена ширењу сојева Mycobacterium tuberculosis из породице W-Beijing (понекад се назива и сој Beijing), који су углавном отпорни на лекове.

Основни захтеви за квалитет молекуларно-биолошких истраживања

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Главни регулаторни документи за спровођење ПЦР-а

Наредбе Министарства здравља Руске Федерације: бр. 45 од 7.02.2000; бр. 109 од 21.03.2003; бр. 64 од 21.02.2000. Смернице: 1.3.1888-04 „Организација рада током PCR истраживања материјала инфицираног патогеним биолошким агенсима III-IV групе патогености“; 1.3.1794-03 „Организација рада током PCR истраживања материјала инфицираног микроорганизмима I-II групе патогености“. 2003; 3.5.5.1034-01 „Дезинфекција тест материјала инфицираног бактеријама I-IV групе патогености при раду PCR методом“, 2001. Додатак 11 Упутству о јединственим методама микробиолошких истраживања у откривању, дијагностици и лечењу туберкулозе.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Особље

Молекуларно-биолошке студије могу спроводити лекари клиничке лабораторијске дијагностике, бактериолози, вирусолози, биолози клиничке дијагностичке лабораторије, као и специјалисти са средњим медицинским образовањем који су прошли специјализацију и усавршавање на утврђени начин.

Уређење лабораторијских просторија

Потребни су следећи лабораторијски објекти:

• Простор за обраду узорака - лабораторија прилагођена за рад са инфективним агенсима групе патогености III-IV, у складу са Методолошким упутствима 13.1888-04.
• Простор за припрему ПЦР реакционих смеша је лабораторијска просторија која пружа заштиту од унутрашње лабораторијске контаминације - „чисто“ подручје.
• • Ако се за анализу PCR производа користи електрофореза или хибридизација, лабораторијска просторија у којој се амплификовани фрагменти ДНК екстрахују из епрувете за амплификацију и, сходно томе, могу ући у животну средину, у складу са захтевима за PCR лабораторије (Методолошке смернице 1.3.1794-03, Методолошке смернице 1.3.1888-04) мора бити потпуно изолована од просторија наведених у претходним пасусима. Кретање било ког особља, опреме, било ког материјала и предмета из простора за електрофорезу у простор за обраду узорака и „чисти“ простор, као и пренос ваздуха кроз вентилациони систем или као резултат промаје, мора бити искључено. Овај простор није потребан за флуориметријску детекцију PCR производа.
• Просторија за документовање и обраду резултата опремљена је рачунарима и потребном канцеларијском опремом. Ова просторија може да садржи опрему која обезбеђује детекцију PCR производа без отварања епрувете. - флуоресцентне PCR детекторе и термоциклере за PCR у реалном времену.

Санитарни и епидемиолошки захтеви за примарну обраду спутума слични су стандардним микробиолошким захтевима за рад са Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Комплетан сет лабораторијске опреме за ПЦР дијагностику

Лабораторијски комплет укључује опрему за следеће просторије.

• Просторија за припрему узорака, садржи следећу опрему: ламинарну капу заштите II класе „СП-1.2“: термостат са грејаним поклопцем за епендорф епрувете; микроцентрифугу на 13.000 о/мин; центрифугу („Вортекс“); фрижидер са температурним опсегом од -20 ^° C до +10 ^° C; пипете променљиве запремине серије „Пролајн“; пумпа са хватаљком ОМ-1; сталак за пипете; сталак радне станице 200x0,5 мл; сталак радне станице 50x1,5 мл; сталак за чување епрувета 80x1,5 мл;
• просторија за припрему реакционе смеше: заштитна комора PCR кутија („Laminar-C. 110 cm); центрифуга „Vortex“; пипете променљиве запремине серије „Proline“; сталак за пипете; сталак за радну станицу 200x0,2 ml; сталаци за чување епрувета 80x1,5 ml; фрижидер са температурним опсегом од -20 ^° C до +10 ^° C;
• Просторија за електрофорезу: хоризонтална комора за електрофорезу; извор напајања; трансилуминатор;
• ДНК појачавач или анализатор нуклеинских киселина (PCR у реалном времену) са рачунаром и софтвером; може се поставити у било коју расположиву просторију. Ако се користи технологија PCR у реалном времену, просторија за електрофорезу није потребна.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Спољна контрола квалитета

Да би се осигурало да добијају објективно поуздане резултате, лабораторије морају учествовати у систему екстерне процене квалитета лабораторијских истраживања.

Учесници у систему контроле квалитета добијају: 12 ампула са лиофилизованим суспензијама бактеријских ћелија, од којих две садрже E. coli, 3 ампуле са микобактеријама туберкулозе (авирулентни сој) у концентрацији од 10² ^/ ml; 3 ампуле са ћелијама сличног соја у концентрацији од 10² ^/ ml; по 2 ампуле са нетуберкулозним микобактеријама M. avium-intracellulare и M. kansasii у концентрацији од 10³ ^/ ml.

Тестови послати на екстерну процену квалитета претходно се тестирају у две независне лабораторије са богатим искуством у овој области.

[ 85 ], [ 86 ]