Коринебактериум

Дифтерија је акутна заразна болест, која углавном погађа децу, а манифестује се као дубока интоксикација организма дифтеријским токсином и карактеристична фибринозна упала на месту локализације патогена. Назив болести потиче од грчке речи дифтера - кожа, филм, јер се на месту размножавања патогена формира густ, сивкасто-бели филм.

Узрочник дифтерије - Corynebacterium diphtheriae - први пут је открио Е. Клебс 1883. године у пресецима филма, а у чистој култури га је 1884. године добио Ф. Лефлер. Године 1888, Е. Ру и А. Јерсин су открили његову способност да производи егзотоксин, који игра главну улогу у етиологији и патогенези дифтерије. Производња антитоксичног серума од стране Е. Беринга 1892. године и његова употреба од 1894. године за лечење дифтерије омогућила је значајно смањење морталитета. Успешан напад на ову болест почео је после 1923. године у вези са развојем методе за добијање дифтеријског анатоксина од стране Г. Рајона.

Узрочник дифтерије припада роду Corynebacterium (класа Actinobacteria). Морфолошки се карактерише тиме што су ћелије палице облика и задебљане на крајевима (грчки coryne - палица), формирају гране, посебно у старим културама, и садрже грануларне инклузије.

Род Corynebacterium обухвата велики број врста, које су подељене у три групе.

• Коринебактерије су паразити људи и животиња и патогене су за њих.
• Коринебактерије патогене за биљке.
• Непатогене коринебактерије. Многе врсте коринебактерија су нормални становници коже, слузокоже ждрела, назофаринкса, очију, респираторног тракта, уретре и гениталија.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Морфологија коринебактерија

C. diphtheriae су прави или благо закривљени непокретни штапићи дужине 1,0-8,0 μm и пречника 0,3-0,8 μm; не формирају споре нити капсуле. Често имају отоке на једном или оба краја и често садрже метахроматске грануле - зрна волутина (полиметафосфате), која добијају плавичасто-љубичасту боју када се обоје метиленским плавим. За њихово откривање предложена је посебна Најсерова метода бојења. У овом случају, штапићи су обојени сламнато жуто, а зрна волутина су тамносмеђа и обично се налазе на половима. Corynebacterium diphtheriae се добро боји анилинским бојама, грам-позитивна је, али у старим културама често мења боју и има негативно бојење по Граму. Карактерише је изражен полиморфизам, посебно у старим културама и под утицајем антибиотика. Садржај G + C у ДНК је око 60 mol %.

Биохемијска својства коринебактерија

Дифтеријски бацил је аероб или факултативно анаероб, температурни оптимум за раст је 35-37 °C (границе раста су 15-40 °C), оптимална pH вредност је 7,6-7,8. Није веома захтевна за хранљиве подлоге, али боље расте на подлогама које садрже серум или крв. Руове или Лефлерове подлоге са згрушаним серумом су селективне за дифтеријске бактерије, раст на њима се појављује након 8-12 сати у облику конвексних колонија величине главе чиоде, сивкасто-беле или жућкасто-крем боје. Њихова површина је глатка или благо зрнаста, на периферији су колоније нешто провидније него у центру. Колоније се не спајају, због чега култура добија изглед шагренске коже. На чорби, раст се манифестује као једнолична замућеност, или чорба остаје провидна, а на њеној површини се формира нежни филм, који се постепено згушњава, мрви и таложи у љуспицама на дну.

Карактеристика бактерија дифтерије је њихов добар раст на крвним и серумским медијумима који садрже такве концентрације калијум телурита да сузбијају раст других врста бактерија. То је због чињенице да C. diphtheriae редукује калијум телурит до металног телуријума, који, депонован у микробним ћелијама, даје колонијама карактеристичну тамно сиву или црну боју. Употреба таквих медијума повећава проценат засејавања бактерија дифтерије.

Коринебактерије дифтерије ферментишу глукозу, малтозу, галактозу уз формирање киселине без гаса, али не ферментишу (по правилу) сахарозу, имају цистиназу, немају уреазу и не формирају индол. Према овим карактеристикама, разликују се од оних коринеформних бактерија (дифтероида) које се најчешће налазе на слузокожи ока (Corynebacterium xerosus) и назофаринкса (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) и од осталих дифтероида.

У природи постоје три главне варијанте (биотипа) дифтеријског бацила: гравис, интермедин и митис. Разликују се по морфолошким, културолошким, биохемијским и другим својствима.

Подела бактерија дифтерије на биотипове извршена је узимајући у обзир облике дифтерије код пацијената код којих се изолују са највећом учесталошћу. Тип gravis се најчешће изолује од пацијената са тешким обликом дифтерије и изазива групне епидемије. Тип mitis изазива блаже и спорадичне случајеве болести, а тип intermedius заузима средњи положај између њих. Corynebacterium belfanti, раније приписан mitis биотипу, изолован је као независни, четврти, биотип. Његова главна разлика од gravis и mitis биотипа је способност редукције нитрата у нитрите. Сојеви Corynebacterium belfanti имају изражена адхезивна својства, а међу њима се налазе и токсигене и нетоксигене варијанте.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Антигена структура коринебактерија

Коринебактерија је веома хетерогена и мозаична. Неколико десетина соматских антигена пронађено је код сва три типа узрочника дифтерије, према којима су подељени на серотипове. У Русији је усвојена серолошка класификација, према којој се разликује 11 серотипова бактерија дифтерије, од којих су 7 главни (1-7) и 4 додатна, ретко сретана серотипова (8-11). Шест серотипова (1, 2, 3, 4, 5, 7) припадају типу gravis, а пет (6,8,9,10,11) типу mitis. Недостатак методе серотипизације је што многи сојеви, посебно нетоксични, имају спонтану аглутинацију или полиаглутинабилност.

[ 11 ]

Фаготипизација Corynebacterium diphtheriae

За диференцијацију бактерија дифтерије предложене су различите шеме типизације фага. Према шеми М. Д. Крилове, коришћењем скупа од 9 фага (А, Б, Ц, Д, Ф, Г, Х, И, К), могуће је типизирати већину токсигених и нетоксигених сојева типа гравис. Узимајући у обзир осетљивост на наведене фаге, као и културна, антигена својства и способност синтезе корицина (бактерицидних протеина), М. Д. Крилова је идентификовала 3 независне групе коринебактерија типа гравис (I-III). Свака од њих садржи подгрупе токсигених и њихове нетоксигене аналоге узрочника дифтерије.

Отпорност на коринебактерије

Коринебактерија дифтерије показује високу отпорност на ниске температуре, али брзо угине на високим температурама: на 60 °C - у року од 15-20 минута, при кључању - после 2-3 минута. Сва дезинфекциона средства (лизол, фенол, хлорамин, итд.) у уобичајено коришћеној концентрацији уништавају је за 5-10 минута. Међутим, узрочник дифтерије добро подноси сушење и може дуго остати одржив у осушеној слузи, пљувачки и честицама прашине. У фином аеросолу, бактерије дифтерије остају одрживе 24-48 сати.

Фактори патогености коринебактерија

Патогеност Corynebacterium diphtheriae одређена је присуством низа фактора.

Фактори адхезије, колонизације и инвазије

Структуре одговорне за адхезију нису идентификоване, али без њих дифтеријски бацил не би могао да колонизује ћелије. Њихову улогу обављају неке компоненте ћелијског зида патогена. Инвазивна својства патогена повезана су са хијалуронидазом, неураминидазом и протеазом.

Токсични гликолипид садржан у ћелијском зиду патогена. То је 6,6'-диестар трехалозе који садржи коринемиколну киселину (C32H64O3) и коринемиколну киселину (C32H62O3) у еквимоларним односима (трехалоза-6,6'-дикоринемикoлат). Гликолипид има деструктивно дејство на ћелије ткива на месту размножавања патогена.

Егзотоксин, који одређује патогеност узрочника и природу патогенезе болести. Нетоксигене варијанте C. diphtheriae не изазивају дифтерију.

Егзотоксин се синтетише као неактивни прекурсор - један полипептидни ланац молекулске тежине 61 kD. Активира га сама бактеријска протеаза, која пресеца полипептид на два пептида повезана дисулфидним везама: А (mw 21 kD) и Б (mw 39 kD). Пептид Б обавља акцепторску функцију - препознаје рецептор, везује се за њега и формира интрамембрански канал кроз који пептид А продире у ћелију и спроводи биолошку активност токсина. Пептид А је ензим АДП-рибозилтрансферазе, који обезбеђује пренос аденозин дифосфат рибозе са НАД-а на један од аминокиселинских остатака (хистидин) фактора елонгације протеина ЕФ-2. Као резултат модификације, ЕФ-2 губи своју активност, а то доводи до супресије синтезе протеина рибозомима у фази транслокације. Токсин синтетишу само оне C. diphtheriae које носе гене умереног конвертујућег профага у свом хромозому. Опереон који кодира синтезу токсина је моноцистронски, састоји се од 1,9 хиљада парова нуклеотида и има toxP промотор и 3 региона: toxS, toxA и toxB. ToxS регион кодира 25 аминокиселинских остатака сигналног пептида (обезбеђује ослобађање токсина кроз мембрану у периплазматски простор бактеријске ћелије), toxA - 193 аминокиселинска остатка пептида А, а toxB - 342 аминокиселинска остатка пептида Б токсина. Губитак профага од стране ћелије или мутације у tox оперону чине ћелију благо токсикогеном. Напротив, лизогенизација нетоксикогених C. diphtheriae од стране конвертујућег фага претвара их у токсикогене бактерије. Ово је недвосмислено доказано: токсикеност бактерија дифтерије зависи од њихове лизогенизације од стране токсик-конвертујућих коринефага. Коринефаги се интегришу у хромозом коринебактерија користећи механизам рекомбинације специфичне за место, а сојеви бактерија дифтерије могу садржати 2 места рекомбинације (attB) у својим хромозомима, а коринефаги се интегришу у свако од њих са истом учесталошћу.

Генетска анализа бројних нетоксигених сојева бактерија дифтерије, спроведена коришћењем обележених ДНК сонди које носе фрагменте коринефагног токс оперона, показала је да њихови хромозоми садрже ДНК секвенце хомологне коринефагном токс оперону, али оне или кодирају неактивне полипептиде или су у „тихом“ стању, тј. неактивним. У вези са тим, поставља се веома важно епидемиолошко питање: да ли се нетоксигене бактерије дифтерије могу трансформисати у токсигене у природним условима (у људском телу), слично ономе што се дешава in vitro? Могућност такве трансформације нетоксигених култура коринебактерија у токсигене коришћењем конверзије фага показана је у експериментима на заморцима, пилећим ембрионима и белим мишевима. Међутим, да ли се то дешава током природног епидемијског процеса (и ако јесте, колико често) још није утврђено.

Због чињенице да дифтеријски токсин у телу пацијената има селективан и специфичан ефекат на одређене системе (углавном су погођени симпатичко-адренални систем, срце, крвни судови и периферни живци), очигледно је да он не само да инхибира биосинтезу протеина у ћелијама, већ изазива и друге поремећаје у њиховом метаболизму.

Следеће методе се могу користити за откривање токсичности бактерија дифтерије:

• Биолошки тестови на животињама. Интрадермална инфекција заморчића филтратом бујонске културе бактерија дифтерије изазива некрозу на месту убризгавања. Једна минимална смртоносна доза токсина (20-30 нг) убија заморчића тежине 250 г када се убризга поткожно 4.-5. дана. Најкарактеристичнија манифестација дејства токсина је оштећење надбубрежних жлезда, које су увећане и оштро хиперемиране.
• Инфекција пилећих ембриона. Дифтеријски токсин узрокује њихову смрт.
• Инфекција ћелијских култура. Дифтеријски токсин изазива изразит цитопатски ефекат.
• Чврстофазни ензимски имуносорбентни тест коришћењем антитоксина обележених пероксидазом.
• Употреба ДНК сонде за директно откривање токсин оперона у хромозому бактерија дифтерије.

Међутим, најједноставнија и најчешћа метода за одређивање токсичности бактерија дифтерије је серолошка - метода гел преципитације. Њена суштина је следећа. Трака стерилног филтер папира димензија 1,5 x 8 цм се навлажи антитоксичним антидифтеријским серумом који садржи 500 АЕ у 1 мл и нанесе на површину хранљиве подлоге у Петријевој шољи. Посуда се суши у термостату 15-20 минута. Тест културе се посеју плаковима са обе стране папира. На једну шољу се посеје неколико сојева, од којих један, очигледно токсичан, служи као контрола. Плоче са културама се инкубирају на 37 °C, резултати се узимају у обзир након 24-48 сати. Због контрадифузије антитоксина и токсина у гелу, на месту њихове интеракције формира се јасна линија преципитације, која се спаја са линијом преципитације контролног токсигеног соја. Неспецифичне преципитационе траке (настају ако су, поред антитоксина, у серуму присутна и друга антимикробна антитела у малим количинама) појављују се касно, слабо су изражене и никада се не спајају са преципитационом траком контролног соја.

Пост-инфективни имунитет

Јаки, упорни, практично доживотни, поновљени случајеви болести се ретко примећују - код 5-7% оних који су преболели болест. Имунитет је углавном антитоксичне природе, антимикробна антитела су од мањег значаја.

Шиков тест је раније био широко коришћен за процену нивоа имунитета против дифтерије. У ту сврху, деци је интрадермално убризгано 1/40 токсина заморца у запремини од 0,2 мл. У одсуству антитоксичног имунитета, на месту убризгавања након 24-48 сати појављују се црвенило и оток пречника већег од 1 цм. Таква позитивна Шикова реакција указује или на потпуно одсуство антитоксина или на то да је његов садржај мањи од 0,001 АЕ/мл крви. Негативна Шикова реакција се примећује када је садржај антитоксина у крви већи од 0,03 АЕ/мл. Ако је садржај антитоксина нижи од 0,03 АЕ/мл, али већи од 0,001 АЕ/мл, Шикова реакција може бити или позитивна или, понекад, негативна. Поред тога, сам токсин има изражено алергено својство. Стога, да би се одредио ниво имунитета против дифтерије (квантитативни садржај антитоксина), боље је користити РПГА са еритроцитним дијагностикумом сензибилизованим дифтеријским токсоидом.

Епидемиологија дифтерије

Једини извор инфекције је особа - болесна особа, особа у опоравку или здрав носилац бактерије. Инфекција се јавља путем капљица у ваздуху, прашине у ваздуху, и путем разних предмета које користе болесни или здрави носиоци: посуђе, књиге, постељина, играчке итд. У случају контаминације прехрамбених производа (млеко, креме итд.), инфекција је могућа путем алиментарног пута. Најмасовније излучивање патогена се јавља код акутног облика болести. Међутим, особе са латентним, атипичним облицима болести су од највећег епидемиолошког значаја, јер се често не хоспитализују и не откривају одмах. Пацијент са дифтеријом је заразан током целог периода болести и дела периода опоравка. Просечан период ношења бактерија код особа у опоравку варира од 2 до 7 недеља, али може трајати и до 3 месеца.

Здрави носиоци играју посебну улогу у епидемиологији дифтерије. У условима спорадичног морбидитета, они су главни дистрибутери дифтерије, доприносећи очувању патогена у природи. Просечно трајање ношења токсигених сојева је нешто краће (око 2 месеца) него нетоксигених (око 2-3 месеца).

Разлог за формирање здравог носиоца токсигених и нетоксигених бактерија дифтерије није у потпуности откривен, јер чак ни висок ниво антитоксичног имунитета не обезбеђује увек потпуно ослобађање организма од патогена. Можда ниво антибактеријског имунитета има одређени значај. Од примарног епидемиолошког значаја је носиоцтво токсигених сојева бактерија дифтерије.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Симптоми дифтерије

Људи било које старости су подложни дифтерији. Патоген може продрети у људски организам кроз слузокожу различитих органа или кроз оштећену кожу. У зависности од локализације процеса, разликују се дифтерија ждрела, носа, гркљана, уха, ока, гениталија и коже. Могући су мешовити облици, на пример, дифтерија ждрела и коже итд. Период инкубације је 2-10 дана. Код клинички израженог облика дифтерије, на месту локализације патогена развија се карактеристична фибринозна упала слузокоже. Токсин који производи патоген прво утиче на епителне ћелије, а затим на оближње крвне судове, повећавајући њихову пропустљивост. Излазећи ексудат садржи фибриноген, чија коагулација доводи до стварања сивкасто-белог филмастог премаза на површини слузокоже, који је чврсто срастао са основним ткивом и, када се откине, изазива крварење. Последица оштећења крвних судова може бити развој локалног едема. Дифтерија ждрела је посебно опасна, јер може изазвати дифтерични круп услед едема слузокоже гркљана и гласних жица, од којег је 50-60% деце оболеле од дифтерије раније умирало као последица асфиксије. Дифтеријски токсин, улазећи у крв, изазива општу дубоку интоксикацију. Углавном погађа кардиоваскуларни, симпатичко-адренални систем и периферне живце. Дакле, симптоми дифтерије састоје се од комбинације локалних знакова који зависе од локализације улазних врата, и општих симптома изазваних тровањем токсином, а манифестују се у облику адинамије, летаргије, бледе коже, ниског крвног притиска, миокардитиса, парализе периферних нерава и других поремећаја. Дифтерија код вакцинисане деце, ако се примети, обично протиче у благом облику и без компликација. Стопа смртности у периоду пре употребе серотерапије и антибиотика била је 50-60%, сада је 3-6%.

Лабораторијска дијагностика дифтерије

Једина метода микробиолошке дијагностике дифтерије је бактериолошка, уз обавезно испитивање изоловане културе коринебактерија на токсичност. Бактериолошка испитивања за дифтерију се спроводе у три случаја:

• за дијагнозу дифтерије код деце и одраслих са акутним инфламаторним процесима у ждријелу, носу и назофаринксу;
• према епидемиолошким индикацијама особа које су биле у контакту са извором узрочника дифтерије;
• особе које су недавно примљене у сиротишта, вртиће, интернате и друге посебне установе за децу и одрасле, како би се међу њима идентификовали могући носиоци бацила дифтерије.

Материјал за проучавање је слуз из ждрела и носа, филм са крајника или других слузокожа, које представљају улазну тачку за патоген. Сетва се врши на телуритни серум или крвне подлоге и истовремено на коагулисани серум Roux (коагулисани коњски серум) или Loeffler (3 дела говеђег серума + 1 део шећерне чорбе) подлоге, на којима се раст коринебактерија појављује након 8-12 сати. Изолована култура се идентификује комбинацијом морфолошких, културних и биохемијских својстава, користећи методе серо- и фаготипизације кад год је то могуће. У свим случајевима, обавезан је тест токсичности коришћењем једне од горе наведених метода. Морфолошке карактеристике коринебактерија се најбоље проучавају коришћењем три методе бојења препарата бриса: Грам, Најсер и метиленско плаво (или толуидинско плаво).

Лечење дифтерије

Специфичан третман за дифтерију је употреба антитоксичног серума против дифтерије који садржи најмање 2000 ИЈ на 1 мл. Серум се примењује интрамускуларно у дозама од 10.000 до 400.000 ИЈ у зависности од тежине болести. Ефикасан метод лечења је употреба антибиотика (пеницилина, тетрациклина, еритромицина итд.) и сулфонамида. Да би се стимулисала производња сопствених антитоксина, може се користити анатоксин. Да би се решили бактерионоше, треба користити антибиотике на које је дати сој коринебактерија веома осетљив.

Специфична профилакса дифтерије

Главна метода борбе против дифтерије је масовна планска вакцинација становништва. У ту сврху користе се различите опције вакцина, укључујући комбиноване, односно усмерене на истовремено стварање имунитета против више патогена. Најраспрострањенија вакцина у Русији је ДПТ. То је суспензија бактерија великог кашља адсорбованих на алуминијум хидроксиду, убијених формалином или тимеросалом (20 милијарди у 1 мл), и садржи дифтеријски токсоид у дози од 30 флокулирајућих јединица и 10 јединица везујућег тетанусног токсоида у 1 мл. Деца се вакцинишу од 3 месеца старости, а затим се спроводе ревакцинације: прва после 1,5-2 године, следеће у доби од 9 и 16 година, а затим сваких 10 година.

Захваљујући масовној вакцинацији, која је почела у СССР-у 1959. године, инциденца дифтерије у земљи до 1966. године, у поређењу са 1958. годином, смањена је 45 пута, а њен индикатор у 1969. години био је 0,7 на 100.000 становника. Накнадно смањење обима вакцинације у 1980-им годинама довело је до озбиљних последица. У периоду 1993-1996. Русију је захватила епидемија дифтерије. Оболели су одрасли, углавном они који нису били вакцинисани, и деца. У 1994. години регистровано је скоро 40 хиљада пацијената. У вези са тим, настављена је масовна вакцинација. Током овог периода вакцинисано је 132 милиона људи, укључујући 92 милиона одраслих. У периоду 2000-2001. године, обухват деце вакцинацијом у утврђеном року био је 96%, а ревакцином - 94%. Због тога је инциденца дифтерије 2001. године смањена за 15 пута у поређењу са 1996. годином. Међутим, да би се инциденца свела на изоловане случајеве, потребно је вакцинисати најмање 97-98% деце у првој години живота и обезбедити масовну ревакцинацију у наредним годинама. Мало је вероватно да ће дифтерија бити потпуно елиминисана у наредним годинама због широко распрострањеног ношења токсигених и нетоксигених бактерија дифтерије. Такође ће бити потребно извесно време да се овај проблем реши.