Витамин А у крви

Референтне вредности (норма) за концентрацију витамина А (ретинола) у крвном серуму: код деце 1-6 година - 0,7-1,5 μmol/l, 7-12 година - 0,91-1,71 μmol/l, 13-19 година - 0,91-2,51 μmol/l; код одраслих - 1,05-2,09 μmol/l.

Витамин А је витамин растворљив у мастима и постоји у два облика: сам витамин А, или ретинол (налази се само у производима животињског порекла) и провитамин А, познат као каротен (добија се из производа животињског и биљног порекла), који се може претворити у ретинол у зидовима дигестивног тракта. Приближно 50-90% ретинола унетог у исхрану се апсорбује у танком цреву и транспортује у комплексу везаном за хиломикрон до јетре, где се складишти као ретинол палмитат. Када је потребно, ослобађа се у крвоток као ретинол у комплексу са протеином који везује витамин А. У крвном серуму, комплекс протеина који везује витамин А + ретинол везује се за транстиретин. Из крвног серума, ретинол апсорбују циљне ћелије, као што су фоторецептори мрежњаче и епитела.

Када тело прими витамин А у количинама које прелазе потребе (180-430 мцг ретинола дневно у зависности од старости, пола и физиолошког стања), његов вишак се таложи у јетри, формирајући депо овог витамина. Када се смањи унос ретинола храном, његове резерве из јетре се ослобађају у крвоток, одржавајући концентрацију ретинола у крвном серуму на нормалном нивоу (изнад 0,7 μmol/l). Други биолошки активни облици витамина А (ретинал и ретиноинска киселина) присутни су у крви у веома ниским концентрацијама (испод 0,35 μmol/l); естри ретинола чине приближно 5% укупног витамина А (0,1-0,17 μmol/l).

Витамин А игра важну улогу у процесима оксидације и редукције. Ретинол подстиче стварање гликогена у јетри и мишићима, помаже у повећању садржаја холестерола у крви и учествује у синтези стероидних и полних хормона. Неопходан је за раст и формирање скелетног система, ресинтезу родопсина, а такође подстиче нормално функционисање слузокоже и покровног епитела коже, спречавајући њену метаплазију, хиперкератозу и прекомерно љуштење. Витамин А помаже у јачању косе, зуба и десни. Последњих година показана је разнолика улога витамина А у превенцији рака и регулисању имунитета (неопходан је за завршетак фагоцитозе, повећава синтезу Ig, стимулише стварање Т-убица, стимулише Т-помоћнике типа II итд.). Витамин А је активни антиоксиданс, који углавном делује у присуству витамина Е; штити витамин Ц од оксидације. Недостатак витамина А сматра се фактором ризика за малигне неоплазме. Експерименталне студије су показале да повећање садржаја витамина А у исхрани повећава средњи животни век за 17,5%. Цинк је есенцијални кофактор у метаболизму витамина А (неопходан за синтезу протеина који везује витамин А).

Просечна дневна потреба за ретинолом за одрасле (20-50 година) је 1,2 мг (4000 ИЈ, 1 ИЈ је еквивалентна 0,3 мцг ретинола), за труднице - 1,5 мг (5000 ИЈ), за дојиље - 1,8 мг (6000 ИЈ), за особе старије од 60 година - 2,5 мг (10.000 ИЈ). Најмање трећина дневне потребе за ретинолом треба да се унесе у организам у готовом облику; остатак се може покрити конзумирањем каротеноида, из којих се ретинол формира у организму. Треба узети у обзир да се приближно 30% ретинола у прехрамбеним производима уништава током термичке обраде. Активност ретинола је 2 пута већа од активности каротена, поред тога, само 30-40% овог другог се апсорбује у цревима. Стога се при процени исхране сматра да је 1 мг ретинола приближно еквивалентно 6 мг каротеноида.

Одређивање ретинола (витамина А) и каротеноида у крвном серуму према Бесеју, модификованом од стране Л.А. Анисимове

Принцип методе

Одређивање витамина А и каротеноида заснива се на њиховој хидролизи у алкалном алкохолном раствору, након чега следи екстракција смешом органских растварача.

Реагенси

• 11 М раствор калијум хидроксида (KOH).
• 96% етил алкохол.
• 1 М раствор калијум хидроксида (KOH) у 96% етил алкохолу: 1 запремина 11 M раствора KOH се меша са 10 запремина 96% етил алкохола. Реагенс се припрема на дан студије. Ако дође до обојења током мешања, алкохол треба пречистити дестилацијом пре употребе.
• Ксилен, хемијски чист
• Октан, хемијски чист
• Смеша ксилена и октана: припремљена мешањем једнаких запремина ксилена и октана.

Студије се спроводе помоћу спектрофотометра.

Процес одређивања витамина А

Крв узета из прста (око 1 мл) се ставља у епрувету за центрифугирање и оставља у стакленој шољи са топлом водом (температура 40-45° C) на 20-30 минута. Да би се серум одвојио, крвни угрушак се пажљиво повлачи око ивице зидова епрувете танким стакленим штапићем и центрифугира на 3000 о/мин током 10 минута.

0,12 мл серума се сакупља и преноси у епрувету за аглутинацију, где се затим додаје 0,12 мл 1 М раствора калијум хидроксида у алкохолу. Садржај се добро промућка.

Епрувете са узорцима се стављају у водено купатило на 20 минута на температури од 60°C да би се извршила хидролиза.

Узорци се хладе и додаје им се 0,12 мл смеше ксилен-октана, и снажно се мућкају 10-15 с. Поново се хладе и центрифугирају.

Горњи слој који садржи витамин А и каротеноиде пажљиво се уклања Пастеровом пипетом са гуменом куглом и преноси у микрокивете.

Узорци се спектрофотометришу на таласној дужини од 328 nm за одређивање витамина А, а на таласној дужини од 460 nm за одређивање каротеноида.

Након спектрофотометрије, узорци се излажу ултраљубичастом зрачењу како би се уништио витамин А. У ту сврху, кварцна (бактерицидна) лампа се поставља на удаљености од 15-20 цм од микрокивета тако да део кивете напуњен течношћу буде изложен зрачењу; време зрачења је 45-60 мин.

Узорци се поново спектрофотометришу на таласној дужини од 328 nm. Садржај витамина А одређује се разликом у вредностима екстинкције (оптичка густина) узимајући у обзир коефицијент (фактор) 637 који је израчунао Беси за витамин А.

Израчунавање се врши према формули:

X = 637 × (Е328(1) - Е328(2)),

Где је X садржај витамина А, μг/дл; 637 је коефицијент који је израчунао Бесеј за одређивање витамина А; E328(1) је оптичка густина раствора пре зрачења; E328(2) је оптичка густина раствора након зрачења.

Коефицијент за претварање концентрације витамина А из µg/dL у µmol/L је 0,035.

Садржај каротеноида се израчунава помоћу формуле:

X = 480-E480,

Где је X садржај каротеноида, μг/дл; 480 је коефицијент који је израчунао Бесеј за одређивање каротеноида; E480 је оптичка густина тест раствора.

Напомена

Према Бесеју, већа или мања запремина серума може се користити приликом спровођења истраживања, али њен однос према запремини алкохолног раствора мора бити константан при свакој промени запремине (количине) смеше ксилен-октана.

Нормалан садржај витамина А у крвном серуму је: код новорођенчади и одојчади - 160-270 μг/л; код одраслих - 1,05-2,45 μмол/л (300-700 μг/л). Садржај каротеноида у крвном серуму одраслих је 800-2300 μг/л.