Улога ензима и цитокина у патогенези остеоартритиса

Последњих година, велика пажња истраживача је усмерена на идентификацију протеаза одговорних за деградацију зглобне хрскавице ECM код остеоартрозе. Према савременим схватањима, матрикс металопротеиназе (MMP) играју важну улогу у патогенези остеоартрозе. Код пацијената са остеоартрозом детектује се повишен ниво три MMP - колагеназе, стромелизина и желатиназе. Колагеназа је одговорна за разградњу нативног колагена, стромелизин - колагена типа IV, протеогликана и ламинина, желатиназа - за разградњу желатина, колагена IV, Vh XI типа, еластина. Поред тога, претпоставља се присуство још једног ензима - агреканазе, која има својства MMP и одговорна је за протеолизу хрскавичавих протеогликанских агрегата.

У људској зглобној хрскавици идентификоване су три врсте колагеназа, чији су нивои значајно повишени код пацијената са остеоартритисом: колагеназа-1 (ММП-1), колагеназа-2 (ММП-8) и колагеназа-3 (ММП-13). Коегзистенција три различита типа колагеназа у зглобној хрскавици сугерише да свака од њих игра своју специфичну улогу. Заиста, колагеназе-1 и -2 су локализоване углавном у површинској и горњој интермедијарној зони зглобне хрскавице, док се колагеназа-3 налази у доњој интермедијарној зони и у дубокој зони. Штавише, резултати имунохистохемијске студије показали су да како остеоартритис напредује, ниво колагеназе-3 достиже плато, па чак и опада, док се ниво колагеназе-1 постепено повећава. Постоје докази да је код остеоартритиса колагеназа-1 углавном укључена у инфламаторни процес у зглобној хрскавици, док је колагеназа-3 укључена у ремоделирање ткива. Колагеназа-3, која се експресује у хрскавици пацијената са остеоартритисом, интензивније разграђује колаген типа II од колагеназе-1.

Од представника друге групе металопротеиназа, три су такође идентификоване у људском стромелизину: стромелизин-1 (ММП-3), стромелизин-2 (ММП-10) и стромелизин-3 (ММП-11). Данас је познато да је само стромелизин-1 укључен у патолошки процес код остеоартрозе. Стромелизин-2 се не детектује у синовијалној мембрани пацијената са остеоартрозом, али се налази у веома малим количинама у синовијалним фибробластима пацијената са реуматоидним артритисом. Стромелизин-3 се такође налази у синовијалној мембрани пацијената са реуматоидним артритисом у близини фибробласта, посебно у зонама фиброзе.

У групи желатиназа у људском хрскавичном ткиву идентификоване су само две: желатиназа од 92 kD (желатиназа Б, или ММП-9) и желатиназа од 72 kD (желатиназа А, или ММП-2); код пацијената са остеоартритисом утврђује се повећање нивоа желатиназе од 92 kD.

Недавно је идентификована још једна група ММП које су локализоване на површини ћелијских мембрана и називају се ММП мембранског типа (ММП-МТ). Ова група обухвата четири ензима - ММП-МТ1 - ММП-МТ-4. Експресија ММП-МТ је пронађена у људској зглобној хрскавици. Иако ММП-МТ-1 има колагеназне особине, оба ензима ММП-МТ-1 и ММП-МТ-2 су способни да активирају желатиназу-72 kDa и колагеназу-3. Улога ове групе ММП у патогенези остеоартритиса захтева разјашњење.

Протеиназе се луче у облику зимогена, који се активира другим протеиназама или органским једињењима живе. Каталитичка активност ММП зависи од присуства цинка у активној зони ензима.

Биолошку активност ММП контролишу специфични ТИМП-ови. До данас су идентификована три типа ТИМП-ова који се налазе у људским зглобним ткивима: ТИМП-1–ТИМП-3. Четврти тип ТИМП-а је идентификован и клониран, али још увек није детектован у људским зглобним ткивима. Ови молекули се специфично везују за активно место ММП-ова, иако су неки од њих способни да се вежу за активно место прожелатиназе од 72 kD (ТИМП-2, -3, -4) и прожелатиназе од 92 kD (ТИМП-1 и -3). Докази указују на то да код остеоартритиса постоји неравнотежа између ММП-ова и ТИМП-ова у зглобној хрскавици, што резултира релативним недостатком инхибитора, вероватно делимично због повећања нивоа активних ММП-ова у ткиву. ТИМП-1 и -2 се налазе у зглобној хрскавици и синтетишу их хондроцити. Код остеоартрозе, само ТИМП типа I је детектован у синовијалној мембрани и синовијалној течности. TIMP-3 се налази искључиво у ECM-у. TIMP-4 дели скоро 50% своје аминокиселинске секвенце са TIMP-2 и 38% са TIMP-1. У другим циљним ћелијама, TIMP-4 је одговоран за модулацију активације 72 kD прожелатиназе на површини ћелије, што указује на важну улогу ткивно специфичног регулатора ремоделирања ECM-а.

Још један механизам за контролу биолошке активности ММП је њихова физиолошка активација. Верује се да су ензими из породице серинских и цистеин протеаза, као што су АП/плазмин и катепсин Б, респективно, физиолошки активатори ММП. Повећани нивои урокиназе (уАП) и плазмина пронађени су у зглобној хрскавици пацијената са остеоартритисом.

Упркос чињеници да се неколико врста катепсина налази у зглобним ткивима, катепсин-Б се сматра највероватнијим активатором ММП у хрскавици. Физиолошки инхибитори серинских и цистеин протеаза пронађени су у људским зглобним ткивима. Активност АП-1 инхибитора (ИАИ-1), као и цистеин протеаза, смањена је код пацијената са остеоартритисом. Слично ММП/ТИМП, неравнотежа између серинских и цистеин протеаза и њихових инхибитора може објаснити повећану активност ММП у зглобној хрскавици пацијената са остеоартритисом. Поред тога, ММП су способни да се међусобно активирају. На пример, стромелизин-1 активира колагеназу-1, колагеназу-3 и 92 kD желатиназу; колагеназа-3 активира 92 kD желатиназу; ММП-МТ активира колагеназу-3, а желатиназа-72 kDa појачава ову активацију; ММП-МТ такође активира желатиназу 72 kDa. Цитокини се могу поделити у три групе - деструктивне (инфламаторне), регулаторне (укључујући антиинфламаторне) и анаболичке (фактори раста).

Типови цитокина (према ван ден Берг ВБ ет ал)

Деструктивно	Интерлеукин-1 TNF-α Фактор инхибиције леукемије Интерлеукин-17
Регулаторни	Интерлеукин-4 Интерлеукин-10 Интерлеукин-13 Инхибитори ензима
Анаболички	Фактори раста слични инсулину ТГФ-б Коштани морфогенетски протеини Морфогенетски протеини изведени из хрскавице

Деструктивни цитокини, посебно IL-1, индукују повећање ослобађања протеаза и инхибирају синтезу протеогликана и колагена од стране хондроцитa. Регулаторни цитокини, посебно IL-4 и -10, инхибирају производњу IL-1, повећавају производњу антагониста IL-1 рецептора (IL-1RA) и смањују ниво NO синтазе у хондроцитима. Дакле, IL-4 делује против IL-1 у три правца: 1) смањује производњу, спречавајући његове ефекте, 2) повећава производњу главног „чистача“ IL-1RA и 3) смањује производњу главног секундарног „гласника“ NO. Поред тога, IL-4 смањује ензимску разградњу ткива. In vivo, оптимални терапеутски ефекат се постиже комбинацијом IL-4 и IL-10. Анаболички фактори као што су TGF-β и IGF-1 заправо не ометају производњу или деловање IL-1, већ показују супротну активност, на пример, стимулишу синтезу протеогликана и колагена, сузбијајући активност протеаза, а TGF-β такође инхибира ослобађање ензима и стимулише њихове инхибиторе.

Проинфламаторни цитокини су одговорни за повећану синтезу и експресију ММП у зглобним ткивима. Синтетишу се у синовијалној мембрани, а затим дифундују у зглобну хрскавицу кроз синовијалну течност. Проинфламаторни цитокини активирају хондроцете, који су заузврат такође способни да производе проинфламаторне цитокине. У зглобовима погођеним остеоартрозом, улогу ефектора упале играју углавном ћелије синовијалне мембране. Управо синовоцити макрофагног типа луче протеазе и инфламаторне медијаторе. Међу њима, IL-f, TNF-a, IL-6, инхибиторни фактор леукемије (LIF) и IL-17 су највише „укључени“ у патогенезу остеоартрозе.

Биолошки активне супстанце које стимулишу разградњу зглобне хрскавице код остеоартритиса

• Интерлеукин-1
• Интерлеукин-3
• Интерлеукин-4
• TNF-α
• Фактори који стимулишу колоније: макрофаги (моноцити) и гранулоцити-макрофаги
• Супстанца П
• СТРАНА ₂
• Активатори плазминогена (ткивни и урокиназни типови) и плазмин
• Металопротеиназе (колагеназе, еластазе, стромелизини)
• Катепсини А и Б
• Трилсин
• Бактеријски липополисахариди
• Фосфолипаза Аг

Подаци из литературе указују да су IL-1 и, могуће, TNF-α главни медијатори уништавања зглобног ткива код остеоартрозе. Међутим, још увек није познато да ли делују независно један од другог или постоји функционална хијерархија између њих. Животињски модели остеоартрозе показали су да блокада IL-1 ефикасно спречава уништавање зглобне хрскавице, док блокада TNF-α доводи само до смањења упале у зглобним ткивима. Повећане концентрације оба цитокина пронађене су у синовијалној мембрани, синовијалној течности и хрскавици пацијената. У хондроцитима, они су у стању да повећају синтезу не само протеаза (углавном MMP и AP), већ и мањих колагена, као што су типови I и III, и смање синтезу колагена типова II и IX и протеогликана. Ови цитокини такође стимулишу реактивне врсте кисеоника и инфламаторне медијаторе као што је PGE2 _. Резултат таквих макромолекуларних промена у зглобној хрскавици код остеоартритиса је неефикасност репаративних процеса, што доводи до даље деградације хрскавице.

Горе поменути проинфламаторни цитокини модулирају процесе супресије/активације ММП код остеоартрозе. На пример, неравнотежа између нивоа ТИМП-1 и ММП у хрскавици код остеоартрозе може бити посредована ИЛ-1, јер је једна in vitro студија показала да повећање концентрације ИЛ-1 бета доводи до смањења концентрације ТИМП-1 и повећања синтезе ММП од стране хондроцита. Синтезу АП такође модулира ИЛ-1 бета. In vitro стимулација хондроцита зглобне хрскавице са ИЛ-1 узрокује повећање синтезе АП зависно од дозе и нагло смањење синтезе иАП-1. Способност ИЛ-1 да смањи синтезу иАП-1 и стимулише синтезу АП је снажан механизам за стварање плазмина и активацију ММП. Поред тога, плазмин није само ензим који активира друге ензиме, већ учествује и у процесу разградње хрскавице директном протеолизом.

ИЛ-ип се синтетише као неактивни прекурсор са масом од 31 kD (пре-ИЛ-ип), а затим се, након цепања сигналног пептида, претвара у активни цитокин са масом од 17,5 kD. У зглобним ткивима, укључујући синовијалну мембрану, синовијалну течност и зглобну хрскавицу, ИЛ-ип се налази у активном облику, а in vivo студије су показале способност синовијалне мембране код остеоартрозе да лучи овај цитокин. Неке серинске протеазе су способне да претворе пре-ИЛ-ип у његов биоактивни облик. Код сисара, таква својства су пронађена само код једне протеазе, која припада породици ензима специфичних за цистеин аспартат и назива се ИЛ-1β-конвертујући ензим (ICF, или каспаза-1). Овај ензим је способан да специфично претвори пре-ИЛ-ип у биолошки активни „зрели“ ИЛ-ип са масом од 17,5 kD. ICF је проензим (p45) од 45 kD који је локализован у ћелијској мембрани. Након протеолитичког цепања проензима p45, формирају се две подјединице познате као p10 и p20, које карактерише ензимска активност.

TNF-α се такође синтетише као мембрански везан прекурсор са масом од 26 kDa; протеолитичким разлагањем се ослобађа из ћелије као активни растворљиви облик са масом од 17 kDa. Протеолитичко разлагање се врши помоћу ензима за конверзију TNF-α (TNF-AC), који припада породици адамализина. AR Amin и др. (1997) су пронашли повећану експресију TNF-AC mRNA у зглобној хрскавици пацијената са остеоартритисом.

Биолошка активација хондроцита и синовоцита помоћу IL-1 и TNF-α посредована је везивањем за специфичне рецепторе на површини ћелије - IL-R и TNF-R. За сваки цитокин идентификована су два типа рецептора - IL-IP типови I и II и TNF-R типови I (p55) и II (p75). IL-1PI и p55 су одговорни за пренос сигнала у ћелијама зглобног ткива. IL-1R тип I има нешто већи афинитет за IL-1β него за IL-1α; IL-1R тип II, напротив, има већи афинитет за IL-1α него за IL-ip. Остаје нејасно да ли IL-IP тип II може посредовати у сигналима IL-1 или служи само за компетитивну инхибицију повезивања IL-1 са IL-1R типом I. Хондроитиди и синовијални фибробласти пацијената са остеоартрозом садрже велике количине IL-1PI и p55, што заузврат објашњава високу осетљивост ових ћелија на стимулацију одговарајућим цитокинима. Овај процес доводи до повећане секреције протеолитичких ензима и уништавања зглобне хрскавице.

Укљученост IL-6 у патолошки процес код остеоартритиса не може се искључити. Ова претпоставка се заснива на следећим запажањима:

• ИЛ-6 повећава број инфламаторних ћелија у синовијалној мембрани,
• ИЛ-6 стимулише пролиферацију хондроцита,
• IL-6 појачава ефекте IL-1 у повећању синтезе MMP и инхибирању синтезе протеогликана.

Међутим, IL-6 је способан да индукује производњу TIMP-ова, али не утиче на производњу MMP-ова, па се сматра да је овај цитокин укључен у процес инхибиције протеолитичке разградње зглобне хрскавице, што се спроводи механизмом повратне спреге.

Још један члан породице IL-6 је LIF, цитокин који производе хондроцити добијени од пацијената са остеоартрозом као одговор на стимулацију проинфламаторним цитокинима IL-1p и TNF-α. LIF стимулише ресорпцију протеогликана хрскавице, као и синтезу MMP и производњу NO. Улога овог цитокина у остеоартрози није у потпуности разјашњена.

IL-17 је хомодимер од 20-30 kD са ефектом сличним IL-1, али много мање израженим. IL-17 стимулише синтезу и ослобађање бројних проинфламаторних цитокина, укључујући IL-1β, TNF-α, IL-6 и MMP у циљним ћелијама, као што су људски макрофаги. Поред тога, IL-17 стимулише производњу NO од стране хондроцита. Као и LIF, улога IL-17 у патогенези остеоартритиса је слабо проучена.

Неоргански слободни радикал NO игра важну улогу у разградњи зглобне хрскавице код остеоартритиса. Хондроцити изоловани од пацијената са остеоартритисом производе веће количине NO и спонтано и након стимулације проинфламаторним цитокинима у поређењу са нормалним ћелијама. Висок садржај NO је пронађен у синовијалној течности и серуму пацијената са остеоартритисом - то је резултат повећане експресије и синтезе индуковане NO синтазе (hNOC), ензима одговорног за производњу NO. Недавно је клонирана ДНК hNOC специфичног за хондроците и одређена је аминокиселинска секвенца ензима. Аминокиселинска секвенца указује на 50% идентитета и 70% сличности са hNOC специфичним за ендотел и нервно ткиво.

NO инхибира синтезу макромолекула ECM зглобне хрскавице и стимулише синтезу MMP. Штавише, повећање производње NO прати смањење синтезе IL-IP антагониста (IL-1RA) од стране хондроцитa. Дакле, повећање нивоа IL-1 и смањење IL-1RA доводи до хиперстимулације NO у хондроцитима, што заузврат доводи до повећане деградације хрскавичног матрикса. Постоје извештаји о терапеутском ефекту in vivo селективног hNOC инхибитора на прогресију експерименталне остеоартрозе.

Природни инхибитори цитокина су у стању да директно спрече везивање цитокина за рецепторе ћелијске мембране, смањујући њихову проинфламаторну активност. Природни инхибитори цитокина могу се поделити у три класе на основу њиховог начина деловања.

Прва класа инхибитора обухвата антагонисте рецептора који спречавају везивање лиганда за његов рецептор конкуришући за место везивања. До данас је такав инхибитор пронађен само за IL-1 - ово је горе поменути конкурентни инхибитор IL-1/ILIP система IL-1 PA. IL-1 PA блокира многе ефекте који се примећују у зглобним ткивима код остеоартритиса, укључујући синтезу простагландина од стране синовијалних ћелија, производњу колагеназе од стране хондроцита и разградњу костне масе зглобне хрскавице.

IL-1RA се налази у различитим облицима - једном растворљивом (rIL-1RA) и два интерћелијска (μIL-lPAI и μIL-1RAP). Афинитет растворљивог облика IL-1RA је 5 пута већи од афинитета интерћелијских облика. Упркос интензивним научним истраживањима, функција овог другог остаје непозната. Експерименти in vitro су показали да инхибиција активности IL-1β захтева концентрацију IL-1RA 10-100 пута већу од нормалне, док in vivo услови захтевају хиљадуструко повећање концентрације IL-1RA. Ова чињеница може делимично објаснити релативни недостатак IL-1RA и вишак IL-1 у синовијуму пацијената са остеоартрозом.

Друга класа природних инхибитора цитокина су растворљиви рецептори цитокина. Примери таквих инхибитора код људи који су повезани са патогенезом остеоартритиса су rIL-1R и pp55. Растворљиви рецептори цитокина су скраћени облици нормалних рецептора; када се вежу за цитокине, спречавају њихово везивање за мембрански повезане рецепторе циљних ћелија, делујући механизмом компетитивног антагонизма.

Главни прекурсор растворљивих рецептора је мембрански везан IL-1RP. Афинитет rIL-IP за IL-1 и IL-1RA је различит. Дакле, rIL-1RN има већи афинитет за IL-1β него за IL-1RA, а rIL-1PI показује већи афинитет за IL-1RA него за IL-ip.

Такође постоје две врсте растворљивих рецептора за TNF - pp55 и pp75, попут растворљивих IL-1 рецептора, они се формирају „одбацивањем“. In vivo, оба рецептора се налазе у ткивима захваћених зглобова. Улога растворљивих TNF рецептора у патогенези остеоартрозе је предмет дебате. Претпоставља се да у ниским концентрацијама стабилизују тродимензионалну структуру TNF-а и повећавају полуживот биоактивног цитокина, док високе концентрације pp55 и pp75 могу смањити активност TNF-а конкурентним антагонизмом. Вероватно, pp75 може деловати као носач TNF-а, олакшавајући његово везивање за рецептор повезан са мембраном.

Трећу класу природних инхибитора цитокина представља група антиинфламаторних цитокина, који укључују TGF-бета, IL-4, IL-10 и IL-13. Антиинфламаторни цитокини смањују производњу проинфламаторних и неких протеаза, и стимулишу производњу IL-1RA и TIMP.