Ограничења, опасности и компликације трансплантације ћелија

Регенеративна пластична медицина заснива се на клиничкој примени тоти- и плурипотентних својстава ембрионалних и прогениторских матичних ћелија, које омогућавају in vitro и in vivo стварање специфичних ћелијских линија које репопулирају оштећена ткива и органе болесне особе.

Реална могућност коришћења ембрионалних матичних ћелија и матичних ћелија дефинитивних ткива (тзв. „одраслих“ матичних ћелија) људи у терапијске сврхе више се не доводи у питање. Међутим, стручњаци Националне и медицинске академије САД (Матичне ћелије и будућа регенеративна медицина National Academy Press) и Националног института за здравље САД (Матичне ћелије и будући правци истраживања. Nat. Inst, of Health USA) препоручују детаљније проучавање својстава матичних ћелија у експериментима на адекватним биолошким моделима и објективну процену свих последица трансплантације, па тек онда користити матичне ћелије у клиници.

Утврђено је да су матичне ћелије део ткивних деривата сва три клицина слоја. Матичне ћелије се налазе у мрежњачи, рожњачи, епидермису коже, коштаној сржи и периферној крви, у крвним судовима, зубној пулпи, бубрегу, гастроинтестиналном епителу, панкреасу и јетри. Коришћењем савремених метода доказано је да су неуралне матичне ћелије локализоване у мозгу и кичменој мождини одрасле особе. Ови сензационални подаци привукли су посебну пажњу научника и медија, будући да су неурони у мозгу послужили као класичан пример статичне ћелијске популације која се не обнавља. И у раном и у касном периоду онтогенезе, неурони, астроцити и олигодендроцити се формирају у мозгу животиња и људи захваљујући неуронским матичним ћелијама (Матичне ћелије: научни напредак и будући правци истраживања. Нац. Институт здравља САД).

Међутим, под нормалним условима, пластичност матичних ћелија дефинитивних ткива се не испољава. Да би се остварио пластични потенцијал матичних ћелија дефинитивних ткива, оне морају бити изоловане, а затим култивисане у медијумима са цитокинима (LIF, EGF, FGF). Штавише, деривати матичних ћелија се успешно прилагођавају само када се трансплантирају у тело животиње са ослабљеним имунолошким системом (γ-зрачење, цитостатици, бусулфан, итд.). До данас нису добијени убедљиви докази о примени пластичности матичних ћелија код животиња које нису биле изложене зрачењу или другим ефектима који изазивају дубоку имуносупресију.

У таквим условима, опасни потенцијал ЕСЦ-а се манифестује, пре свега, током њихове трансплантације у ектопичне области - током поткожне ињекције ЕСЦ-а у имунодефицијентне мишеве, на месту ињекције се формирају тератокарциноми. Поред тога, током развоја људског ембриона, учесталост хромозомских абнормалности је већа него у ембриогенези код животиња. У фази бластоцисте, само 20-25% људских ембриона састоји се од ћелија са нормалним кариотипом, а огромна већина раних људских ембриона добијених након вантелесне оплодње показује хаотичан хромозомски мозаицизам и веома често се сусреће са нумеричким и структурним аберацијама.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Благотворни ефекти матичних ћелија

Прелиминарни резултати клиничких испитивања потврђују благотворно дејство матичних ћелија на пацијента, али још увек нема информација о дугорочним ефектима трансплантације ћелија. У литератури су у почетку доминирали извештаји о позитивним резултатима трансплантације фрагмената ембрионалног мозга код Паркинсонове болести, али су се затим почели појављивати подаци који негирају ефикасан терапеутски ефекат ембрионалног или феталног нервног ткива трансплантираног у мозак пацијената.

Средином 20. века први пут је откривена рестаурација хематопоезе код смртоносно озрачених животиња након интравенске трансфузије ћелија коштане сржи, а 1969. године амерички истраживач Д. Томас извршио је прву трансплантацију коштане сржи код људи. Недостатак знања о механизмима имунолошке некомпатибилности ћелија коштане сржи донора и примаоца у то време довео је до високе смртности због честог неуспеха трансплантације и развоја реакције калем-против-домаћина. Откриће главног комплекса хистокомпатибилности, који укључује људске леукоцитарне антигене (HbA), и побољшање метода њиховог типизирања омогућили су значајно повећање преживљавања након трансплантације коштане сржи, што је довело до широке употребе ове методе лечења у онкохематологији. Деценију касније, извршене су прве трансплантације хематопоетских матичних ћелија (HSC) добијених из периферне крви помоћу леукаферезе. Године 1988, крв из пупчане врпце је први пут коришћена као извор ХСК у Француској за лечење детета са Фанконијевом анемијом, а од краја 2000. године у штампи се појављују извештаји о способности ХСК да се диференцирају у ћелије различитих типова ткива, што потенцијално проширује обим њихове клиничке примене. Међутим, испоставило се да материјал за трансплантацију, заједно са ХСК, садржи значајан број нечистоћа нехематопоетских ћелија различите природе и својстава. У том смислу, развијају се методе за пречишћавање трансплантата и критеријуми за процену његове ћелијске чистоће. Конкретно, користи се позитивна имуноселекција CD34+ ћелија, која омогућава изолацију ХСК помоћу моноклонских антитела.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Компликације терапије матичним ћелијама

Компликације код трансплантације коштане сржи су најчешће хематолошке и повезане су са дугим периодом јатрогене панцитопеније. Најчешће се развијају инфективне компликације, анемија и хеморагије. У том смислу, изузетно је важно одабрати оптималан начин сакупљања, обраде и складиштења коштане сржи ради максималног очувања матичних ћелија, што ће обезбедити брзу и стабилну обнову хематопоезе. Приликом карактеризације трансплантата, тренутно се уобичајено процењују следећи параметри: број мононуклеарних и/или нуклеарних ћелија, јединице које формирају колоније и садржај CD34-позитивних ћелија. Нажалост, ови индикатори пружају само индиректну процену стварног хематопоетског капацитета популације матичних ћелија трансплантата. Данас не постоје апсолутно тачни параметри за одређивање довољности трансплантата за дугорочну обнову хематопоезе код пацијената, чак ни код аутологне трансплантације коштане сржи. Развој општих критеријума је изузетно тежак због недостатка строгих стандарда за обраду, криопрезервацију и тестирање трансплантата. Поред тога, неопходно је узети у обзир читав низ фактора који утичу на параметре успешног обнављања хематопоезе код сваког појединачног пацијента. Код аутологне трансплантације коштане сржи, најважнији од њих су број претходних курсева хемотерапије, карактеристике режима кондиционирања, период болести у којем је коштана срж сакупљена и шеме коришћења фактора који стимулишу колоније у посттрансплантационом периоду. Поред тога, не треба заборавити да хемотерапија која претходи сакупљању трансплантата може имати негативан ефекат на матичне ћелије коштане сржи.

Учесталост тешких токсичних компликација значајно се повећава током алогене трансплантације коштане сржи. У том смислу, интересантни су статистички подаци о алогеној трансплантацији коштане сржи код таласемије. Извештаји Европске групе за трансплантацију коштане сржи регистровали су око 800 трансплантација коштане сржи пацијентима са таласемијом мајор. Алогена трансплантација код таласемије се у великој већини случајева врши од ХЛА-идентичних браће и сестара, што је повезано са тешким компликацијама и високом смртношћу током трансплантације материјала матичних ћелија од делимично компатибилних сродних или компатибилних несродних донора. Да би се смањио ризик од фаталних инфективних компликација, пацијенти се смештају у изоловане асептичне кутије са ламинарним протоком ваздуха и добијају дијету са ниским садржајем бактерија или абсорбујуће бактерије. За бактеријску деконтаминацију црева, перорално се прописују нерезорбујући облици антибиотика и антифунгални лекови. За профилаксу се амфотерицин Б примењује интравенозно. Превенција системских инфекција појачава се амикацином и цефтазидимом, који се прописују дан пре трансплантације, а лечење се наставља док се пацијент не отпусти. Сви крвни производи се озрачавају дозом од 30 Gy пре трансфузије. Парентерална исхрана током трансплантације је неопходан услов и почиње одмах након ограничавања уноса хране природним путем.

Низ компликација повезан је са високом токсичношћу имуносупресивних лекова, који често изазивају мучнину, повраћање и мукозитис, оштећење бубрега и интерстицијалну пнеумонију. Једна од најтежих компликација хемотерапије је вено-оклузивна болест јетре, која доводи до смрти у раном посттрансплантационом периоду. Фактори ризика за тромбозу вена порталног система јетре укључују старост пацијената, присуство хепатитиса и фиброзе јетре, као и имуносупресивну терапију након трансплантације коштане сржи. Вено-оклузивна болест је посебно опасна код таласемије, коју прати хемосидероза јетре, хепатитис и фиброза - чести пратиоци трансфузијске терапије. Тромбоза вена порталног система јетре развија се 1-2 недеље након трансплантације и карактерише се брзим повећањем садржаја билирубина и активности трансаминаза у крви, прогресијом хепатомегалије, асцитесом, енцефалопатијом и болом у горњем делу стомака. Хистолошки, обдукцијски материјал открива оштећење ендотела, субендотелне хеморагије, оштећење центрилобуларних хепатоцита, тромботичку опструкцију венула и централних вена јетре. Код пацијената са таласемијом описани су случајеви фаталног срчаног застоја повезаног са токсичним дејством цитостатика.

Током периода пре трансплантације, циклофосфамид и бусулфан често изазивају токсично-хеморагични циститис са патолошким променама у уроепителним ћелијама. Употреба циклоспорина А код трансплантације коштане сржи често је праћена нефро- и неуротоксичношћу, хипертензивним синдромом, задржавањем течности у организму и цитолизом хепатоцита. Сексуална и репродуктивна дисфункција се чешће примећује код жена. Код мале деце, пубертетски развој обично није погођен након трансплантације, али код старије деце, патологија развоја сексуалне сфере може бити веома озбиљна - до стерилитета. Компликације директно повезане са самом трансплантацијом укључују одбацивање алогених ћелија коштане сржи, АБО инкомпатибилност, акутни и хронични облици болести калем-против-домаћина.

Код пацијената са АБО-некомпатибилном трансплантацијом коштане сржи, изоаглутинини домаћина наспрам АБО донора се производе 330-605 дана након трансплантације, што може довести до продужене хемолизе и драматично повећати потребу за трансфузијом крви. Ова компликација се спречава трансфузијом само црвених крвних зрнаца типа 0. Након трансплантације, неки пацијенти доживљавају аутоимуну неутропенију, тромбоцитопенију или панцитопенију, што захтева спленектомију за корекцију.

Код 35-40% прималаца, акутна болест калем-против-домаћина развија се у року од 100 дана након алогене трансплантације коштане сржи идентичне са HLA. Степен захваћености коже, јетре и црева варира од осипа, дијареје и умерене хипербилирубинемије до десквамације коже, цревне опструкције и акутне инсуфицијенције јетре. Код пацијената са таласемијом, инциденца акутне болести калем-против-домаћина I степена након трансплантације коштане сржи је 75%, а II и вишег степена је 11-53%. Хронична болест калем-против-домаћина као системски мултиоргански синдром обично се развија у року од 100-500 дана након алогене трансплантације коштане сржи код 30-50% пацијената. Захваћени су кожа, усна дупља, јетра, очи, једњак и горњи респираторни тракт. Прави се разлика између ограниченог облика хроничне болести калем-против-домаћина, када су захваћени кожа и/или јетра, и распрострањеног облика, када су генерализоване кожне лезије комбиноване са хроничним агресивним хепатитисом, лезијама очију, пљувачних жлезда или било ког другог органа. Смрт је често узрокована инфективним компликацијама које настају услед тешке имунодефицијенције. Код таласемије, благи облик хроничне болести калем-против-домаћина јавља се код 12%, умерени облик код 3%, а тежак облик код 0,9% прималаца алогене ХЛА-компатибилне коштане сржи. Тешка компликација трансплантације коштане сржи је одбацивање калема, које се развија 50-130 дана након операције. Учесталост одбацивања зависи од режима кондиционирања. Конкретно, код пацијената са таласемијом који су током периода припреме примали само метотрексат, одбацивање трансплантата коштане сржи је примећено у 26% случајева, уз комбинацију метотрексата са циклоспорином А - у 9% случајева, а уз примену само циклоспорина А - у 8% случајева (Gaziev et al., 1995).

Инфективне компликације након трансплантације коштане сржи узроковане су вирусима, бактеријама и гљивицама. Њихов развој је повезан са дубоком неутропенијом изазваном хемотерапијским лековима током периода кондиционирања, оштећењем мукозних баријера цитостатицима и реакцијом калем-против-домаћина. У зависности од времена развоја, разликују се три фазе инфективних компликација. У првој фази (развија се у првом месецу након трансплантације) преовлађују оштећење мукозних баријера и неутропенија, често праћене вирусним инфекцијама (херпес, Епштајн-Баров вирус, цитомегаловирус, Варицела зостер), као и инфекцијама изазваним грам-позитивним и грам-негативним бактеријама, гљивицама Кандида, аспергилима. У раном посттрансплантационом периоду (други и трећи месец након трансплантације), најтежа инфекција је цитомегаловирус, која често доводи до смрти пацијената у другој фази инфективних компликација. Код таласемије, цитомегаловирусна инфекција након трансплантације коштане сржи развија се код 1,7-4,4% прималаца. Трећа фаза се примећује у касном посттрансплантационом периоду (три месеца након операције) и карактерише је тешка комбинована имунодефицијенција. Инфекције изазване Варицелом зостер, стрептококом, Пнеумоцистис карини, Неисеријом менингитидис, Хаемофилус инфлуенце и хепатотропним вирусима су честе током овог периода. Код таласемије, морталитет пацијената након трансплантације коштане сржи повезан је са бактеријском и гљивичном сепсом, идиопатском интерстицијалном и цитомегаловирусном пнеумонијом, акутним респираторним дистресом, акутном срчаном инсуфицијенцијом, срчаном тампонадом, церебралним крварењем, вено-оклузивном болешћу јетре и акутном болешћу калем-против-домаћина.

Тренутно су постигнути одређени успеси у развоју метода за изоловање чистих популација хематопоетских матичних ћелија из коштане сржи. Техника за добијање феталне крви из пупчане врпце је унапређена, а створене су и методе за изоловање хематопоетских ћелија из крви из пупчане врпце. У научној штампи постоје извештаји да су хематопоетске матичне ћелије способне за умножавање када се култивишу у медијумима са цитокинима. Приликом коришћења специјално дизајнираних биореактора за ширење хематопоетских матичних ћелија, биомаса хематопоетских матичних ћелија изолованих из коштане сржи, периферне или крви из пупчане врпце значајно се повећава. Могућност ширења хематопоетских матичних ћелија је важан корак ка клиничком развоју трансплантације ћелија.

Међутим, пре ин витро размножавања хематопоетских матичних ћелија, неопходно је изоловати хомогену популацију хематопоетских матичних ћелија. То се обично постиже коришћењем маркера који омогућавају селективно обележавање хематопоетских матичних ћелија моноклонским антителима ковалентно везаним за флуоресцентну или магнетну ознаку и њихову изолацију коришћењем одговарајућег ћелијског сортера. Истовремено, питање фенотипских карактеристика хематопоетских матичних ћелија није коначно решено. А. Петренко, В. Гришченко (2003) сматрају ћелије са CD34, AC133 и Thyl антигенима на својој површини и без CD38, HLA-DR или других маркера диференцијације (ћелије са CD34+Liir фенотипом) кандидатима за хематопоетске матичне ћелије. Лозни (Lin) маркери укључују гликофорин А (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Ћелије са фенотипом CD34+CD45RalüW CD71low, као и фенотипом CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, сматрају се обећавајућим за трансплантацију.

Питање броја хематопоетских матичних ћелија довољних за ефикасну трансплантацију остаје проблематично. Тренутно, извори хематопоетских матичних ћелија су коштана срж, периферна и пупчана крв, као и ембрионална јетра. Експанзија хематопоетских матичних ћелија постиже се њиховим култивисањем у присуству ендотелних ћелија и хематопоетских фактора раста. У различитим протоколима, мијелопротеини, SCF, еритропоетин, инсулину слични фактори раста, кортикостероиди и естрогени се користе за индуковање пролиферације HSC. Када се користе комбинације цитокина in vitro, могуће је постићи значајно повећање HSC фонда са врхунцем њихове продукције на крају друге недеље култивације.

Традиционално, трансплантација хематопоетских матичних ћелија из пупчане врпце користи се углавном за хемобластозе. Међутим, минимална доза хематопоетских ћелија потребна за успешну трансплантацију ћелија из пупчане врпце је 3,7 x 10 ⁷ нуклеарних ћелија на 1 кг телесне тежине примаоца. Коришћење мањег броја хематопоетских матичних ћелија из пупчане врпце значајно повећава ризик од неуспеха калема и рецидива болести. Стога се трансплантација хематопоетских матичних ћелија из пупчане врпце углавном користи за лечење хемобластоза код деце.

Нажалост, још увек не постоје стандарди за набавку или стандардизовани протоколи за клиничку употребу хематопоетских ћелија из крви пупчане врпце. Сходно томе, саме матичне ћелије из крви пупчане врпце нису легално признати извор хематопоетских ћелија за трансплантацију. Поред тога, не постоје етичке или правне норме које регулишу активности и организацију банака крви из пупчане врпце, какве постоје у иностранству. У међувремену, ради безбедне трансплантације, сви узорци крви из пупчане врпце морају се пажљиво пратити. Пре прикупљања крви од труднице, мора се добити њен пристанак. Свака трудница мора бити прегледана на носиоштво HBsAg, присуство антитела на вирусе хепатитиса Ц, ХИВ и сифилиса. Сваки узорак крви из пупчане врпце мора се стандардно тестирати на број нуклеарних ћелија, CD34+ и капацитет формирања колонија. Поред тога, врши се HbA типизација, одређивање крвне групе помоћу АБО и њене припадности помоћу Rh фактора. Неопходне процедуре тестирања су бактериолошка култура за стерилност, серолошко тестирање на HIV-1 и HIV-2 инфекције, HBsAg, вирусни хепатитис C, цитомегаловирусну инфекцију, HTLY-1 и HTLY-II, сифилис и токсоплазмозу. Поред тога, ланчана реакција полимеразе се изводи за откривање цитомегаловирусних и HIV инфекција. Чини се препоручљивим допунити протоколе тестирања анализом GSC крви из пупчане врпце како би се откриле генетске болести као што су α-таласемија, анемија српастих ћелија, недостатак аденозин деаминазе, Брутонова агамаглобулинемија, Хурлерова и Понтерова болест.

Следећа фаза припреме за трансплантацију је питање очувања хематопоетских матичних ћелија. Најопаснији поступци за виталност ћелија током њихове припреме су замрзавање и одмрзавање. Приликом замрзавања хематопоетских ћелија, значајан део њих може бити уништен због формирања кристала. За смањење процента ћелијске смрти користе се посебне супстанце - криопротектори. Најчешће се ДМСО користи као криопротектор у коначној концентрацији од 10%. Међутим, ДМСО у таквој концентрацији карактерише директан цитотоксични ефекат, који се манифестује чак и под условима минималне експозиције. Смањење цитотоксичног ефекта постиже се строгим одржавањем нулте температуре режима експозиције, као и поштовањем прописа за обраду материјала током и након одмрзавања (брзина свих манипулација, коришћење вишеструких поступака прања). Не треба користити концентрације ДМСО мање од 5%, јер то узрокује масовну смрт хематопоетских ћелија током периода замрзавања.

Присуство нечистоћа еритроцита у суспензионој смеши хематопоетских матичних ћелија ствара ризик од развоја реакције некомпатибилности за еритроцитне антигене. Истовремено, када се еритроцити уклоне, губитак хематопоетских ћелија значајно се повећава. У том смислу, предложена је метода нефракционисане изолације хематопоетских матичних ћелија. У овом случају, користи се 10% раствор ДМСО и хлађење константном брзином (ГС/мин) до -80°C да би се заштитиле ћелије са нуклеом од штетних ефеката ниских температура, након чега се ћелијска суспензија замрзава у течном азоту. Верује се да ова метода криопрезервације резултира делимичном лизом еритроцита, тако да узорци крви не захтевају фракционисање. Пре трансплантације, ћелијска суспензија се одмрзава, испира од слободног хемоглобина и ДМСО у раствору хуманог албумина или у крвном серуму. Очување хематопоетских прекурсора коришћењем ове методе је заиста веће него након фракционисања крви из пупчане врпце, али ризик од трансфузијских компликација услед трансфузије АБО-некомпатибилних еритроцита остаје.

Успостављање банкарског система за складиштење HLA-тестираних и типизираних узорака HSC могло би да реши горе наведене проблеме. Међутим, то захтева развој етичких и правних норми, о којима се тренутно само расправља. Пре стварања банкарске мреже, неопходно је усвојити низ прописа и докумената о стандардизацији поступака за прикупљање, фракционисање, тестирање и типизацију, као и криопрезервацију HSC. Обавезан услов за ефикасан рад HSC банака је организација рачунарске базе за интеракцију са регистрима Светског удружења донора коштане сржи (WMDA) и Националног програма за доноре коштане сржи Сједињених Држава (NMDP).

Поред тога, неопходно је оптимизовати и стандардизовати методе ин витро експанзије ХСК, првенствено хематопоетских ћелија из крви из пупчане врпце. Експанзија ХСК из крви из пупчане врпце је неопходна како би се повећао број потенцијалних прималаца компатибилних са ХЛА системом. Због малих запремина крви из пупчане врпце, број ХСК садржаних у њој обично није у стању да обезбеди репопулацију коштане сржи код одраслих пацијената. Истовремено, за извођење несродних трансплантација, неопходно је имати приступ довољном броју типизираних узорака ХСК (од 10.000 до 1.500.000 по примаоцу).

Трансплантација хематопоетских матичних ћелија не елиминише компликације које прате трансплантацију коштане сржи. Анализе показују да се код трансплантације матичних ћелија из пупчане врпце тешки облици акутне болести калем-против-домаћина развијају код 23% прималаца, а хронични облици код 25% прималаца. Код онкохематолошких пацијената, рецидиви акутне леукемије током прве године након трансплантације матичних ћелија из пупчане врпце примећују се у 26% случајева.

Последњих година интензивно се развијају методе трансплантације периферних хематопоетских матичних ћелија. Садржај ХСК у периферној крви је толико мали (1 ХСК на 100.000 крвних зрнаца) да њихова изолација без посебне припреме нема смисла. Стога се донору прво даје курс медикаментозне стимулације ослобађања хематопоетских ћелија коштане сржи у крв. У ту сврху користе се далеко од безопасних лекова као што су циклофосфамид и фактор који стимулише колоније гранулоцита. Али чак и након поступка мобилизације ХСК у периферну крв, садржај CD34+ ћелија у њему не прелази 1,6%.

За мобилизацију хематопоетских матичних ћелија у клиници се најчешће користи S-SEC, који карактерише релативно добра толеранција, са изузетком готово природне појаве болова у костима. Треба напоменути да употреба савремених сепаратора крви омогућава ефикасну изолацију хематопоетских матичних ћелија. Међутим, под нормалним условима хематопоезе, мора се извршити најмање 6 процедура да би се добио довољан број хематопоетских матичних ћелија упоредивих по капацитету репопулације са суспензијом коштане сржи. Свака таква процедура захтева 10-12 литара крви која се обради на сепаратору, што може изазвати тромбоцитопенију и леукопенију. Поступак сепарације подразумева уношење антикоагуланта (натријум цитрата) донору, што, међутим, не искључује контактну активацију тромбоцита током екстракорпоралне центрифугације. Ови фактори стварају услове за развој инфективних и хеморагичних компликација. Још један недостатак методе је значајна варијабилност мобилизационог одговора, што захтева праћење садржаја ХСК у периферној крви донора, што је неопходно за одређивање њиховог максималног нивоа.

Аутогена трансплантација хематопоетских матичних ћелија, за разлику од алогене трансплантације, потпуно елиминише развој реакције одбацивања. Међутим, значајан недостатак аутотрансплантације хематопоетских матичних ћелија, који ограничава опсег индикација за њену примену, јесте велика вероватноћа реинфузије леукемијских клонских ћелија са трансплантатом. Поред тога, одсуство имунолошки посредованог ефекта „калемац против тумора“ значајно повећава учесталост рецидива малигних болести крви. Стога, једини радикални метод елиминације неопластичне клоналне хематопоезе и обнављања нормалне поликлоналне хематопоезе код мијелодиспластичних синдрома остаје интензивна полихемотерапија са трансплантацијом алогене хематопоезе.

Али чак и у овом случају, лечење већине хемобластоза има за циљ само повећање времена преживљавања пацијената и побољшање њиховог квалитета живота. Према неколико великих студија, дугорочно преживљавање без рецидива након алотрансплантације ХСК постиже се код 40% онкохематолошких пацијената. Приликом коришћења матичних ћелија ХЛА-компатибилног брата или сестре, најбољи резултати се примећују код младих пацијената са кратком историјом болести, бројем бластних ћелија до 10% и повољном цитогенетиком. Нажалост, морталитет повезан са поступком алотрансплантације ХСК код пацијената са мијелодиспластичним болестима остаје висок (у већини извештаја - око 40%). Резултати 10-годишњег рада Националног програма за донорство коштане сржи у САД (510 пацијената, средња старост - 38 година) указују да је преживљавање без рецидива током две године 29% са релативно ниском вероватноћом рецидива (14%). Међутим, морталитет повезан са поступком алотрансплантације ХСК од несродног донора је изузетно висок и достиже 54% током двогодишњег периода. Слични резултати су добијени у европској студији (118 пацијената, средња старост - 24 године, двогодишње преживљавање без рецидива - 28%, рецидив - 35%, морталитет - 58%).

Током интензивних курсева хемотерапије са накнадним обнављањем хематопоезе алогеним хематопоетским ћелијама, често се јављају имунохематолошке и трансфузијске компликације. Оне су углавном последица чињенице да се људске крвне групе наслеђују независно од МХЦ молекула. Стога, чак и ако су донор и прималац компатибилни за главне ХЛА антигене, њихови еритроцити могу имати различите фенотипове. Прави се разлика између „велике“ некомпатибилности, када прималац има претходно постојећа антитела на еритроцитне антигене донора, и „мање“ некомпатибилности, када донор има антитела на еритроцитне антигене примаоца. Могући су случајеви комбинације „велике“ и „мање“ некомпатибилности.

Резултати упоредне анализе клиничке ефикасности алотрансплантације хематопоетских матичних ћелија коштане сржи и пупчане врпце код хемобластоза указују да је код деце након алотрансплантације хематопоетских матичних ћелија из пупчане врпце значајно смањен ризик од развоја реакције калем-против-домаћина, али се примећује дужи период опоравка броја неутрофила и тромбоцита са већом инциденцом морталитета након 100 дана након трансплантације.

Проучавање узрока ране смртности омогућило је разјашњење контраиндикација за алогенску трансплантацију ХСК, међу којима су најважније:

• присуство позитивних тестова на цитомегаловирусну инфекцију код примаоца или донора (без превентивног лечења);
• акутна радијациона болест;
• присуство или чак сумња на присуство микотичке инфекције код пацијента (без спровођења системске ране профилаксе фунгицидним лековима);
• хемобластозе, код којих су пацијенти примали дуготрајно лечење цитостатицима (због велике вероватноће изненадног срчаног застоја и отказивања више органа);
• трансплантација од HLA-неидентичних донора (без профилаксе акутне реакције калем-против-домаћина циклоспорином А);
• хронични вирусни хепатитис Ц (због високог ризика од развоја вено-оклузивне болести јетре).

Дакле, трансплантација ХСК може изазвати озбиљне компликације, које често доводе до смрти. У раном (до 100 дана након трансплантације) периоду, то укључује инфективне компликације, акутну болест калем-против-домаћина, одбацивање калема (отказ донорских ХСК), вено-оклузивну болест јетре, као и оштећење ткива изазвано токсичношћу режима кондиционирања, који карактерише висока стопа ремоделирања (кожа, васкуларни ендотел, цревни епител). Компликације касног периода након трансплантације укључују хроничну болест калем-против-домаћина, рецидиве основне болести, заостајање у расту код деце, дисфункцију репродуктивног система и штитне жлезде, као и оштећење ока.

Недавно се, у вези са публикацијама о пластичности ћелија коштане сржи, појавила идеја о коришћењу ХСК за лечење срчаних удара и других болести. Иако неки експерименти на животињама подржавају ову могућност, закључке о пластичности ћелија коштане сржи потребно је потврдити. Ову околност треба да узму у обзир они истраживачи који верују да се трансплантиране ћелије људске коштане сржи лако трансформишу у ћелије скелетних мишића, миокарда или ЦНС-а. Хипотеза да су ХСК природни ћелијски извор регенерације ових органа захтева озбиљне доказе.

Конкретно, објављени су први резултати отворене рандомизоване студије В. Беленкова (2003). Њен циљ је био да се проучи ефекат C-SvK (тј. мобилизације аутологних ХСК у крв) на клинички, хемодинамски и неурохуморални статус пацијената са умереном до тешком хроничном срчаном инсуфицијенцијом, као и да се процени његова безбедност у односу на стандардну терапију (инхибитори ангиотензин-конвертујућег ензима, бета-блокатори, диуретици, срчани гликозиди). У првој публикацији резултата студије, аутори програма напомињу да је једини аргумент у корист O-SvK резултат лечења једног пацијента, који је показао неспорно побољшање свих клиничких и хемодинамских параметара у односу на терапију овим леком. Међутим, теорија о мобилизацији ХСК у крвоток са накнадном регенерацијом миокарда у постинфарктној зони није потврђена - чак ни код пацијента са позитивном клиничком динамиком, стрес ехокардиографија са добутамином није открила појаву зона одрживог миокарда у подручју ожиљка.

Треба напоменути да тренутно очигледно нема довољно података да би се препоручила терапија заменом ћелија за широку примену у свакодневној клиничкој пракси. Потребне су добро осмишљене и висококвалитетне клиничке студије како би се утврдила ефикасност различитих опција за регенеративну ћелијску терапију, развиле индикације и контраиндикације за њу, као и смернице за комбиновану употребу регенеративно-пластичне терапије и традиционалног хируршког или конзервативног лечења. Још увек нема одговора на питање која одређена популација ћелија коштане сржи (матичне хематопоетске или стромалне) може дати неуроне и кардиомиоците, а такође је нејасно који услови доприносе томе in vivo.

Рад у овим областима се спроводи у многим земљама. У резимеу симпозијума о акутној инсуфицијенцији јетре Националних института за здравље САД, међу обећавајућим методама лечења, уз трансплантацију јетре, наводи се трансплантација ксено- или алогених хепатоцита и екстракорпорално повезивање биореактора са ћелијама јетре. Постоје директни докази да су само страни функционално активни хепатоцити у стању да пруже ефикасну подршку јетри примаоца. За клиничку употребу изолованих хепатоцита неопходно је створити ћелијску банку, што ће значајно смањити време између изолације ћелија и њихове употребе. Најприхватљивија метода за стварање банке изолованих хепатоцита је криопрезервација ћелија јетре у течном азоту. Приликом коришћења таквих ћелија у клиници код пацијената са акутном и хроничном инсуфицијенцијом јетре, откривен је прилично висок терапеутски ефекат.

Упркос оптимистичним и охрабрујућим резултатима трансплантације ћелија јетре у експериментима и клиничкој пракси, још увек постоји много проблема који су далеко од решавања. То укључује ограничен број органа погодних за добијање изолованих хепатоцита, недовољно ефикасне методе за њихову изолацију, одсуство стандардизованих метода за очување ћелија јетре, нејасне идеје о механизмима раста и регулације пролиферације трансплантираних ћелија, одсуство адекватних метода за процену калемљења или одбацивања алогених хепатоцита. Ово такође укључује присуство трансплантационог имунитета при коришћењу алогених и ксеногених ћелија, иако мање него код ортотопске трансплантације јетре, али захтева употребу имуносупресора, енкапсулацију изолованих хепатоцита или њихов посебан третман ензимима. Трансплантација хепатоцита често доводи до имунолошког сукоба између примаоца и донора у облику реакције одбацивања, што захтева употребу цитостатика. Једно решење за овај проблем може бити употреба полимерних микропорозних носача за изолацију ћелија јетре, што ће побољшати њихово преживљавање, будући да мембрана капсуле ефикасно штити хепатоците упркос имунизацији домаћина.

Међутим, код акутне инсуфицијенције јетре, таква трансплантација хепатоцита је неефикасна због релативно дугог времена потребног да се ћелије јетре прилагоде новом окружењу и достигну фазу оптималног функционисања. Потенцијално ограничење је лучење жучи током ектопичне трансплантације изолованих хепатоцита, а при коришћењу биореактора, значајна физиолошка баријера је неусклађеност врста између људских протеина и протеина које производе ксеногени хепатоцити.

У литератури постоје извештаји да локална трансплантација стромалних матичних ћелија коштане сржи олакшава ефикасну корекцију коштаних дефеката, а рестаурација коштаног ткива у овом случају се одвија интензивније него код спонтане репаративне регенерације. Неколико преклиничких студија на експерименталним моделима убедљиво демонстрира могућност коришћења трансплантација стромалних ћелија коштане сржи у ортопедији, иако је потребан даљи рад на оптимизацији ових метода, чак и у најједноставнијим случајевима. Конкретно, оптимални услови за ширење остеогених стромалних ћелија ex vivo још увек нису пронађени, а структура и састав њиховог идеалног носача (матрикса) остају неразвијени. Минималан број ћелија потребан за волуметријску регенерацију костију није одређен.

Доказано је да мезенхималне матичне ћелије показују трансгермалну пластичност, тј. способност диференцијације у ћелијске типове фенотипски неповезане са ћелијама оригиналне линије. Под оптималним условима култивације, поликлоналне линије стромалних матичних ћелија коштане сржи могу да издрже више од 50 деоба in vitro, што омогућава добијање милијарди стромалних ћелија из 1 мл аспирата коштане сржи. Међутим, популација мезенхималних матичних ћелија је хетерогена, што се манифестује како варијабилношћу у величинама колонија, различитим брзинама њиховог формирања, тако и морфолошком разноликошћу ћелијских типова, од вретенастих ћелија сличних фибробластима до великих равних ћелија. Фенотипска хетерогеност се примећује након само 3 недеље култивације стромалних матичних ћелија: неке колоније формирају нодуле коштаног ткива, друге формирају кластере адипоцита, а треће, ређе, формирају острвца хрскавичног ткива.

Трансплантација ембрионалног нервног ткива је првобитно коришћена за лечење дегенеративних болести централног нервног система. Последњих година, уместо ембрионалног можданог ткива, трансплантирани су ћелијски елементи неуросфера добијених из неуралних матичних ћелија (Полтавцева, 2001). Неуросфере садрже посвећене прекурсоре неурона и неуроглије, што даје наду за обнављање изгубљених можданих функција након њихове трансплантације. Након трансплантације диспергованих ћелија неуросфере у стријатумски регион мозга пацова, примећена је њихова пролиферација и диференцијација у допаминергичке неуроне, што је елиминисало моторну асиметрију код пацова са експерименталним хемипаркинсонизмом. Међутим, у неким случајевима, тумори су се развили из ћелија неуросфере, што је довело до смрти животиња (Бјорклунд, 2002).

У клиници, пажљиве студије две групе пацијената, у којима ни пацијенти ни лекари који су их посматрали нису знали (двоструко слепа студија), да је једној групи пацијената трансплантирано ембрионално ткиво са неуронима који производе допамин, а друга група пацијената је подвргнута лажној операцији, дале су неочекиване резултате. Пацијенти којима је трансплантирано ембрионално нервно ткиво нису се осећали ништа боље од пацијената у контролној групи. Поред тога, 5 од 33 пацијента је развило перзистентну дискинезију 2 године након трансплантације ембрионалног нервног ткива, што није било присутно код пацијената у контролној групи (Матичне ћелије: научни напредак и будући правци истраживања. Национални институт за здравље. САД). Један од нерешених проблема клиничког истраживања неуронских матичних ћелија мозга остаје анализа стварних перспектива и ограничења трансплантације њихових деривата за корекцију поремећаја ЦНС-а. Могуће је да неуроногенеза у хипокампусу изазвана продуженом нападном активношћу, што доводи до његове структурне и функционалне реорганизације, може бити фактор у прогресивном развоју епилепсије. Овај закључак заслужује посебну пажњу, јер указује на могуће негативне последице стварања нових неурона у зрелом мозгу и формирања аберантних синаптичких веза од стране њих.

Не треба заборавити да култивација у медијумима са цитокинима (митогенима) приближава карактеристике матичних ћелија онима туморских ћелија, будући да се код њих дешавају сличне промене у регулацији ћелијских циклуса, што одређује способност неограничене деобе. Непромишљено је трансплантирати ране деривате ембрионалних матичних ћелија у особу, јер је у том случају претња од развоја малигних неоплазми веома висока. Много је безбедније користити њихово посвећеније потомство, односно ћелије прекурсоре диференцираних линија. Међутим, тренутно још увек није развијена поуздана техника за добијање стабилних линија људских ћелија које се диференцирају у жељеном смеру.

Употреба технологија молекуларне биологије за корекцију наследне патологије и људских болести модификовањем матичних ћелија је од великог интереса за практичну медицину. Карактеристике генома матичних ћелија омогућавају развој јединствених шема трансплантације за корекцију генетских болести. Међутим, постоји низ ограничења у овој области која треба превазићи пре практичне примене генетског инжењеринга матичних ћелија. Пре свега, неопходно је оптимизовати процес ex vivo модификације генома матичних ћелија. Познато је да дуготрајна (3-4 недеље) пролиферација матичних ћелија смањује њихову трансфекцију, па је неопходно неколико циклуса трансфекције да би се постигао висок ниво њихове генетске модификације. Међутим, главни проблем је повезан са трајањем терапијске експресије гена. До сада, ни у једној студији период ефективне експресије након трансплантације модификованих ћелија није прешао четири месеца. У 100% случајева, током времена, експресија трансфектованих гена се смањује због инактивације промотера и/или смрти ћелија са модификованим геномом.

Важно питање је трошак коришћења ћелијских технологија у медицини. На пример, процењена годишња потреба за финансирање само медицинских трошкова јединице за трансплантацију коштане сржи, дизајниране за обављање 50 трансплантација годишње, износи око 900.000 америчких долара.

Развој ћелијских технологија у клиничкој медицини је сложен и вишестепени процес који подразумева конструктивну сарадњу између мултидисциплинарних научних и клиничких центара и међународне заједнице. Истовремено, питања научне организације истраживања у области ћелијске терапије захтевају посебну пажњу. Најважнија од њих су развој протокола клиничких истраживања, контрола поузданости клиничких података, формирање националног регистра студија, интеграција у међународне програме мултицентричних клиничких студија и имплементација резултата у клиничку праксу.

Закључујући увод у проблеме ћелијске трансплантологије, желео бих да изразим наду да ће обједињавање напора водећих украјинских стручњака из различитих области науке обезбедити значајан напредак у експерименталним и клиничким истраживањима и омогућити да се у наредним годинама пронађу ефикасни начини пружања помоћи тешко оболелим људима којима је потребна трансплантација органа, ткива и ћелија.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]