Хематопоетске матичне ћелије

Хематопоетске матичне ћелије (ХСК), као и мезенхималне прогениторске ћелије, карактерише мултипотенција и дају ћелијске линије, чији коначни елементи чине формиране елементе крви, као и бројне специјализоване ткивне ћелије имуног система.

Хипотеза о постојању заједничког прекурсора свих крвних ћелија, као и сам термин „матична ћелија“, припада А. Максимову (1909). Потенцијал за формирање ћелијске масе код ХСЦ је огроман - матичне ћелије коштане сржи дневно производе 10 ћелија које чине формиране елементе периферне крви. Сама чињеница постојања хематопоетских матичних ћелија утврђена је 1961. године у експериментима на обнављању хематопоезе код мишева који су примили смртоносну дозу радиоактивног зрачења које уништава матичне ћелије коштане сржи. Након трансплантације сингених ћелија коштане сржи таквим смртоносно озраченим животињама, у слезини прималаца пронађени су дискретни жаришта хематопоезе, чији су извор биле појединачне клоногене прекурсорске ћелије.

Тада је доказана способност хематопоетских матичних ћелија за самоодржавање, обезбеђујући функцију хематопоезе у процесу онтогенезе. У процесу ембрионалног развоја, ХСК се одликују високом миграционом активношћу, неопходном за њихово кретање у зоне формирања хематопоетских органа. Ово својство ХСК је очувано и у онтогенези - због њихове сталне миграције долази до перманентног обнављања фонда имунокомпетентних ћелија. Способност ХСК да мигрирају, продиру кроз хистохематске баријере, имплантирају се у ткива и клоногенски расту послужила је као основа за трансплантацију ћелија коштане сржи код низа болести повезаних са патологијом хематопоетског система.

Као и сви ресурси матичних ћелија, хематопоетске матичне ћелије су присутне у својој ниши (коштаној сржи) у веома малим количинама, што узрокује одређене потешкоће у њиховој изолацији. Имунофенотипски, људске ХСК се карактеришу као CD34+NK ћелије способне да мигрирају у крвоток и насељавају органе имуног система или репопулирају строму коштане сржи. Треба јасно разумети да ХСК нису најнезрелије ћелије коштане сржи, већ потичу од прекурсора, који укључују успаване CD34-негативне ћелије сличне фибробластима. Утврђено је да су ћелије са CD34 фенотипом способне да уђу у општи крвоток, где мењају свој фенотип у CD34+, али приликом обрнуте миграције у коштану срж, под утицајем микроокружења, поново постају CD34-негативни елементи матичних ћелија. У стању мировања, CD34~ ћелије не реагују на паракрине регулаторне сигнале строме (фактори раста, цитокини). Међутим, у ситуацијама које захтевају повећан интензитет хематопоезе, матичне ћелије са CD34 фенотипом реагују на сигнале диференцијације формирањем и хематопоетских и мезенхималних ћелија прогенитора. Хематопоеза се одвија директним контактом ХСК са ћелијским елементима строме коштане сржи, коју представља сложена мрежа макрофага, ретикуларних ендотелних ћелија, остеобласта, стромалних фибробласта и екстрацелуларног матрикса. Стромална основа коштане сржи није само матрикс или „скелет“ за хематопоетско ткиво; она спроводи фину регулацију хематопоезе захваљујући паракриним регулаторним сигналима фактора раста, цитокина и хемокина, а такође обезбеђује адхезивне интеракције неопходне за формирање крвних зрнаца.

Дакле, стално обнављајући систем хематопоезе заснован је на полипотентној (са становишта хематопоезе) хематопоетској матичној ћелији способној за дугорочно самоодржавање. У процесу обавезивања, ХСК подлежу примарној диференцијацији и формирају клонове ћелија које се разликују по цитоморфолошким и имунофенотипским карактеристикама. Секвенцијално формирање примитивних и обавезаних ћелија прогенитора завршава се формирањем морфолошки идентификованих ћелија прогенитора различитих хематопоетских линија. Резултат наредних фаза сложеног вишестепеног процеса хематопоезе је сазревање ћелија и ослобађање зрелих формираних елемената у периферну крв - еритроцита, леукоцита, лимфоцита и тромбоцита.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Извори хематопоетских матичних ћелија

Хематопоетске матичне ћелије се сматрају најпроучаванијим извором матичних ћелија, што је углавном због њихове клиничке употребе у трансплантацији коштане сржи. На први поглед, о овим ћелијама се зна доста. Донекле, то је тачно, будући да су средњи и зрели потомци ХСК најприступачнији ћелијски елементи, од којих је сваки (еритроцити, леукоцити, лимфоцити, моноцити/макрофаги и тромбоцити) пажљиво проучаван на свим нивоима - од светлосне до електронске микроскопије, од биохемијских и имунофенотипских карактеристика до идентификације методама ПЦР анализе. Међутим, праћење морфолошких, ултраструктурних, биохемијских, имунофенотипских, биофизичких и геномских параметара ХСК није дало одговоре на многа проблематична питања, чије је решавање неопходно за развој ћелијске трансплантологије. Механизми стабилизације хематопоетских матичних ћелија у стању мировања, њихова активација, улазак у фазу симетричне или асиметричне деобе, а што је најважније, посвећеност формирању тако функционално различитих формираних елемената крви као што су еритроцити, леукоцити, лимфоцити и тромбоцити, још увек нису утврђени.

Присуство у коштаној сржи ћелија са фенотипом CD34, које су преци и мезенхималних и хематопоетских матичних ћелија, покренуло је питање постојања најранијих прекурсора ћелијске диференцијације у стромалне и хематопоетске лозе, блиске CD34-негативним ћелијама. Такозване ћелије које иницирају дугорочну културу (LTC-IC) добијене су коришћењем методе дугорочне култивације. Животни век таквих ћелија прекурсора са активношћу формирања колонија на стромалној основи коштане сржи са одређеном комбинацијом фактора раста прелази 5 недеља, док је виталност посвећених јединица које формирају колоније (CFU) у култури само 3 недеље. Тренутно се LTC-IC сматра функционалним аналогом HSC, јер са високим потенцијалом репопулације, око 20% LTC-IC карактерише CD34+CD38- фенотип и показује висок капацитет за самообнављање. Такве ћелије се налазе у људској коштаној сржи са учесталошћу од 1:50.000. Међутим, ћелије које иницијатира мијелоидно-лимфоидне ћелије, које се добијају под дугорочним (15 недеља) условима култивације, требало би препознати као најближе ХСК ћелијама. Такве ћелије, означене као ЛТЦ, спадају међу ћелије коштане сржи људског мозга и налазе се 10 пута ређе од ЛТЦ-ИЦ и формирају ћелијске линије и мијелоидних и лимфоидних хематопоетских лоза.

Иако је обележавање хематопоетских матичних ћелија моноклонским антителима праћено имунофенотипском идентификацијом главна метода за препознавање и селективно сортирање хематопоетских ћелија са матичним потенцијалом, клиничка примена тако изолованих ХСК је ограничена. Блокирање CD34 рецептора или других маркер антигена антителима током имунопозитивног сортирања неизбежно мења својства ћелије изоловане уз његову помоћ. Имунонегативна изолација ХСК на магнетним колонама се сматра пожељнијом. Међутим, у овом случају се за сортирање обично користе моноклонска антитела фиксирана на металном носачу. Поред тога, што је важно, обе методе изолације ХСК заснивају се на фенотипским, а не на функционалним карактеристикама. Стога, многи истраживачи више воле да користе анализу клоногених параметара ХСК, што омогућава да се степен зрелости и смер диференцијације ћелија прогенитора одреде величином и саставом колонија. Познато је да се током процеса обавезивања број ћелија и њихови типови у колонији смањују. Хематопоетска матична ћелија и њена рана ћелија-кћерка, названа „јединица за формирање колонија гранулоцит-еритроцит-моноцит-мегакариоцит“ (CFU-GEMM), стварају велике вишелинијске колоније у култури које садрже гранулоците, еритроците, моноците и мегакариоците, респективно. Јединица за формирање колонија гранулоцит-моноцит (CFU-GM), која се налази низводно дуж линије обавезивања, формира колоније гранулоцита и макрофага, а јединица за формирање колонија гранулоцита (CFU-G) формира само малу колонију зрелих гранулоцита. Рани прекурсор еритроцита, јединица за формирање еритроцита која формира експлозију (CFU-E), је извор великих еритроцитних колонија, а зрелија јединица за формирање колонија еритроцита (CFU-E) је извор малих еритроцитних колонија. Генерално, када ћелије расту на получврстим медијумима, могу се идентификовати ћелије које формирају шест врста мијелоидних колонија: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E и CFU-E).

Међутим, поред хематопоетских деривата, сваки изворни материјал за изоловање ХСК садржи значајан број пратећих ћелија. У том смислу, претходно пречишћавање трансплантата је неопходно, пре свега, од активних ћелија имуног система донора. Обично се у ту сврху користи имуноселекција, заснована на експресији специфичних антигена од стране лимфоцита, што омогућава њихово изоловање и уклањање помоћу моноклонских антитела. Поред тога, развијена је имунорозетна метода исцрпљивања Т-лимфоцита трансплантата коштане сржи, која се заснива на формирању комплекса CD4+ лимфоцита и специфичних моноклонских антитела, ефикасно уклоњених помоћу аферезе. Ова метода обезбеђује производњу пречишћеног ћелијског материјала са 40-60% садржаја хематопоетских матичних ћелија.

Повећање броја ћелија прогенитора услед уклањања зрелих формираних елемената крви из производа леукаферезе постиже се контраструјном центрифугирањем након чега следи филтрација (у присуству хелатора - тринатријум цитрата) кроз колоне које садрже најлонска влакна обложена људским имуноглобулином. Секвенцијална употреба ове две методе обезбеђује потпуно пречишћавање трансплантата од тромбоцита, 89% од еритроцита и 91% од леукоцита. Због значајног смањења губитка ХСЦ, ниво CD34+ ћелија у укупној ћелијској маси може се повећати до 50%.

Способност изолованих хематопоетских матичних ћелија да формирају колоније зрелих крвних зрнаца у култури користи се за функционалну карактеризацију ћелија. Анализа формираних колонија омогућава идентификацију и квантификацију типова ћелија прогенитора, степена њихове посвећености и утврђивање правца њихове диференцијације. Клоногена активност се одређује у получврстим медијумима на метилцелулози, агару, плазми или фибринском гелу, који смањују миграциону активност ћелија, спречавајући њихово везивање за површину стакла или пластике. Под оптималним условима култивације, клонови се развијају из једне ћелије за 7-18 дана. Ако клон садржи мање од 50 ћелија, идентификује се као један кластер; ако број ћелија прелази 50, идентификује се као колонија. Узима се у обзир број ћелија способних да формирају колонију (јединице које формирају колоније - CFU или ћелије које формирају колоније - COC). Треба напоменути да параметри CFU и COC не одговарају броју HSC у ћелијској суспензији, иако корелирају са њим, што још једном наглашава потребу за одређивањем функционалне (колонијалне) активности HSC in vitro.

Међу ћелијама коштане сржи, хематопоетске матичне ћелије имају највећи пролиферативни потенцијал, због чега формирају највеће колоније у култури. Предлаже се да број таквих колонија индиректно одређује број матичних ћелија. Након формирања колонија in vitro пречника већег од 0,5 mm и са бројем ћелија већим од 1000, аутори су тестирали такве ћелије на отпорност на сублеталне дозе 5-флуороурацила и проучавали њихову способност да репопулирају коштану срж летално озрачених животиња. Према наведеним параметрима, изоловане ћелије су се готово не разликовале од HSC и добиле су скраћеницу HPP-CFC - ћелије које формирају колоније са високим пролиферативним потенцијалом.

Потрага за квалитетнијом изолацијом хематопоетских матичних ћелија се наставља. Међутим, хематопоетске матичне ћелије су морфолошки сличне лимфоцитима и представљају релативно хомоген скуп ћелија са скоро округлим једрима, фино диспергованим хроматином и малом количином слабо базофилне цитоплазме. Њихов тачан број је такође тешко утврдити. Претпоставља се да се ХСК у људској коштаној сржи јављају са учесталошћу од 1 на 106 нуклеарних ћелија.

Идентификација хематопоетских матичних ћелија

Да би се побољшао квалитет идентификације хематопоетских матичних ћелија, спроводи се секвенцијална или симултана (на вишеканалном сортирачу) студија спектра мембрански везаних антигена, а код ХСК фенотип CD34+CD38 треба комбиновати са одсуством маркера линеарне диференцијације, посебно антигена имунокомпетентних ћелија, као што су CD4, површински имуноглобулини и гликофорин.

Скоро све шеме фенотипизације хематопоетских матичних ћелија укључују одређивање антигена CD34. Овај гликопротеин са молекулском тежином од око 110 kDa, који носи неколико места гликозилације, експресује се на мембрани плазма ћелија након активације одговарајућег гена локализованог на хромозому 1. Функција молекула CD34 повезана је са интеракцијом раних хематопоетских ћелија прогенитора посредованом L-селектином са стромалном основом коштане сржи. Међутим, треба имати на уму да присуство антигена CD34 на површини ћелије омогућава само прелиминарну процену садржаја HSC у ћелијској суспензији, пошто га експресују и друге хематопоетске ћелије прогенитора, као и стромалне ћелије коштане сржи и ендотелне ћелије.

Током диференцијације хематопоетских ћелија прогенитора, експресија CD34 је трајно смањена. Еритроцитне, гранулоцитне и моноцитне посвећене ћелије прогенитора или слабо експресују CD34 антиген или га уопште не експресују на својој површини (CD34 фенотип). CD34 антиген се не детектује на површинској мембрани диференцираних ћелија коштане сржи и зрелих крвних ћелија.

Треба напоменути да у динамици диференцијације хематопоетских ћелија прогенитора не само да се смањује ниво експресије CD34, већ се прогресивно повећава и експресија антигена CD38, интегралног мембранског гликопротеина са молекулском тежином од 46 kDa, који има NAD-гликохидролазну и ADP-рибозил циклазну активност, што указује на његово учешће у транспорту и синтези ADP-рибозе. Стога се појављује могућност двоструке контроле степена посвећености хематопоетских ћелија прогенитора. Популација ћелија са CD34+CD38+ фенотипом, која чини од 90 до 99% CD34-позитивних ћелија коштане сржи, садржи ћелије прогенитора са ограниченим пролиферативним и диференцијационим потенцијалом, док ћелије са CD34+CD38 фенотипом могу преузети улогу HSC.

Заиста, популација ћелија коштане сржи описана формулом CD34+CD38- садржи релативно велики број примитивних матичних ћелија способних за диференцијацију у мијелоидном и лимфоидном правцу. У условима дуготрајног култивисања ћелија са фенотипом CD34+CD38-, могуће је добити све зреле формиране елементе крви: неутрофиле, еозинофиле, базофиле, моноците, мегакариоците, еритроците и лимфоците.

Релативно недавно је утврђено да CD34-позитивне ћелије експресују још два маркера, AC133 и CD90 (Thy-1), који се такође користе за идентификацију хематопоетских матичних ћелија. Thy-1 антиген се коекспресује са CD117 рецептором (c-kit) на CD34+ ћелијама коштане сржи, пупчане врпце и периферне крви. То је површински гликопротеин који везује фосфатидилинозитол, молекулске тежине 25-35 kDa, који учествује у процесима ћелијске адхезије. Неки аутори сматрају да је Thy-1 антиген маркер најнезрелијих CD34-позитивних ћелија. Саморепродукујуће ћелије са CD34+Thy-1+ фенотипом дају дугорочно култивисане линије са формирањем ћелија-кћери. Претпоставља се да Thy-1 антиген блокира регулаторне сигнале који изазивају заустављање деобе ћелија. Упркос чињеници да су CD34+Thy1+ ћелије способне за саморепродукцију и стварање дугорочно култивисаних линија, њихов фенотип се не може приписати искључиво HSC ћелијама, будући да је садржај Thy-1+ у укупној маси CD34-позитивних ћелијских елемената око 50%, што значајно премашује број хематопоетских ћелија.

Перспективнији за идентификацију хематопоетских матичних ћелија требало би да буде AC133 - антигенски маркер хематопоетских ћелија прогенитора, чија је експресија први пут откривена на ембрионалним ћелијама јетре. AC133 је трансмембрански гликопротеин који се појављује на површини ћелијске мембране у најранијим фазама сазревања HSC - могуће је да чак и раније од CD34 антигена. У студијама А. Петренка, В. Гришченка (2003) утврђено је да AC133 експресује до 30% CD34-позитивних ембрионалних ћелија јетре.

Дакле, идеалан фенотипски профил хематопоетских матичних ћелија, према тренутним концептима, састоји се од ћелијског обриса, чије контуре треба да укључују конфигурације антигена CD34, AC133 и Thy-1, али нема места за молекуларне пројекције CD38, HLA-DR и маркере линеарне диференцијације GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Варијација фенотипског портрета ХСЦ може бити комбинација CD34+CD45RalowCD71low, будући да се својства ћелија описаних овом формулом не разликују од функционалних параметара ћелија са фенотипом CD34+CD38. Поред тога, људске ХСЦ могу се идентификовати по фенотипским карактеристикама CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit /low - само 30 таквих ћелија потпуно обнавља хематопоезу код летално озрачених мишева.

Четрдесетогодишњи период интензивног истраживања ХСК, које су способне и за саморепродукцију и за диференцијацију у друге ћелијске елементе, започео је анализом општих фенотипских карактеристика ћелија коштане сржи, што је омогућило оправдање употребе трансплантације коштане сржи за лечење различитих патологија хематопоетског система. Нове врсте матичних ћелија откривене касније још увек нису широко примењене у клиничкој пракси. Истовремено, матичне ћелије крви пупчане врпце и ембрионалне јетре способне су да значајно прошире обим трансплантације ћелија не само у хематологији, већ и у другим областима медицине, будући да се разликују од ХСК коштане сржи и по квантитативним карактеристикама и по квалитативним одликама.

Запремина масе хематопоетских матичних ћелија потребна за трансплантацију обично се добија из коштане сржи, периферне и пупчане крви, и ембрионалне јетре. Поред тога, хематопоетске прогениторске ћелије могу се добити in vitro умножавањем ЕСЦ са њиховом накнадном усмереном диференцијацијом у хематопоетске ћелијске елементе. А. Петренко, В. Гришченко (2003) с правом примећују значајне разлике у имунолошким својствима и способности обнављања хематопоезе ХСЦ различитог порекла, што је последица неједнаког односа раних плурипотентних и касно посвећених прогениторских ћелија садржаних у њиховим изворима. Поред тога, хематопоетске матичне ћелије добијене из различитих матичних извора карактеришу квантитативно и квалитативно потпуно различите асоцијације нехематопоетских ћелија.

Коштана срж је већ постала традиционални извор хематопоетских матичних ћелија. Суспензија ћелија коштане сржи се добија из илијума или грудне кости испирањем под локалном анестезијом. Суспензија добијена на овај начин је хетерогена и садржи мешавину ХСК, елемената стромалних ћелија, посвећених прогениторских ћелија мијелоидних и лимфоидних линија, као и зрелих формираних елемената крви. Број ћелија са фенотиповима CD34+ и CD34+CD38 међу мононуклеарним ћелијама коштане сржи је 0,5-3,6 и 0-0,5%, респективно. Периферна крв након G-CSF-индуковане мобилизације ХСК садржи 0,4-1,6% CD34+ и 0-0,4% CD34+CD38.

Проценат ћелија са имунофенотиповима CD34+CD38 и CD34+ је већи у крви из пупчане врпце - 0-0,6 и 1-2,6%, а њихов максималан број је детектован међу хематопоетским ћелијама ембрионалне јетре - 0,2-12,5 и 2,3-35,8%, респективно.

Међутим, квалитет трансплантираног материјала не зависи само од броја CD34+ ћелија које садржи, већ и од њихове функционалне активности, која се може проценити нивоом формирања колонија in vivo (репопулација коштане сржи код смртоносно озрачених животиња) и in vitro - растом колонија на полутечним медијумима. Испоставило се да активност формирања колонија и пролиферације хематопоетских ћелија прогенитора са CD34+CD38 HLA-DR фенотипом изолованих из ембрионалне јетре, феталне коштане сржи и крви из пупчане врпце значајно премашује пролиферативни и потенцијал формирања колонија хематопоетских ћелија коштане сржи и периферне крви одрасле особе. Квантитативна и квалитативна анализа ХСЦ различитог порекла открила је значајне разлике како у њиховом релативном садржају у ћелијској суспензији, тако и у функционалним могућностима. Максималан број CD34+ ћелија (24,6%) пронађен је у трансплантираном материјалу добијеном из феталне коштане сржи. Коштана срж одрасле особе садржи 2,1% CD34-позитивних ћелијских елемената. Међу мононуклеарним ћелијама периферне крви одрасле особе, само 0,5% има CD34+ фенотип, док у крви из пупчане врпце њихов број достиже 2%. Истовремено, капацитет формирања колонија CD34+ ћелија феталне коштане сржи је 2,7 пута већи од клоналног капацитета раста хематопоетских ћелија коштане сржи одрасле особе, а ћелије крви из пупчане врпце формирају знатно више колонија него хематопоетски елементи изоловани из периферне крви одраслих: 65,5 и 40,8 колонија/105 ћелија, респективно.

Разлике у пролиферативној активности и капацитету хематопоетских матичних ћелија за формирање колонија повезане су не само са различитим степенима њихове зрелости, већ и са њиховим природним микроокружењем. Познато је да су интензитет пролиферације и брзина диференцијације матичних ћелија одређени интегралним регулаторним ефектом вишекомпонентног система фактора раста и цитокина које производе и саме матичне ћелије и ћелијски елементи њиховог матрикс-стромалног микроокружења. Употреба пречишћених ћелијских популација и медијума без серума за култивацију ћелија омогућила је карактеризацију фактора раста који имају стимулативни и инхибиторни ефекат на матичне ћелије различитих нивоа, прогениторске ћелије и ћелије посвећене у једном или другом линеарном смеру. Резултати студија убедљиво указују на то да се ХСК добијене из извора са различитим нивоима онтогенетског развоја разликују и фенотипски и функционално. ХСК у ранијим фазама онтогенезе карактеришу висок потенцијал саморепродукције и висока пролиферативна активност. Такве ћелије се одликују дужим теломерима и подлежу посвећености да формирају све хематопоетске ћелијске линије. Одговор имуног система на ХСК ембрионалног порекла је одложен, јер такве ћелије слабо експресују ХЛА молекуле. Постоји јасна градација релативног садржаја ХСК, њиховог капацитета самообнављања и броја типова линија обавезивања које формирају: CD34+ ћелије ембрионалне јетре > CD34+ ћелије пупчане врпце > CD34+ ћелије коштане сржи. Важно је да су такве разлике својствене не само интра-, нео- и раним постнаталним периодима људског развоја, већ и целокупној онтогенези - пролиферативна и колонијална активност ХСК добијених из коштане сржи или периферне крви одрасле особе је обрнуто пропорционална старости донора.