Хематопоиетичне матичне ћелије

Хематопоетске матичне ћелије (ХСЦС) као месенхималне родитељских ћелија одликују мултипотенци и доводе до ћелијске линије, коначних елемената који формирају крвних зрнаца и неке специјализоване ћелије ткива имуног система.

Хипотеза о постојању заједничког претка свих крвних ћелија, као и термин "стем ћелије", у власништву А. Макимов (1909) Потенцијал Формирање ћелијске масе из ГСК огроман -. Коштана срж матичних ћелија произведе 10. Дана ћелије које чине крвна зрнца самог периферних. Постојање хематопоезних матичних ћелија је основан 1961. Године у експериментима на опоравку хематопоезе код мишева који примају смртоносну дозу радијације која разара коштане сржи матичне ћелије Поз. Односно трансплантација коштане сржи сингеним ћелијама тако смртно озрачене животиње дискретном фокусе хематопоезе су откривени у слезини прималаца чији извор - Сингле цлоногениц родитељских ћелија.

Потом је доказана способност хематопоиетских матичних ћелија на самоподржавање, што пружа функцију хематопоезе током онтогенезе. У процесу ембрионалног развоја ХСЦ карактерише висока миграциона активност која је неопходна за њихову миграцију на места хематопоетских органа. Ова особина ХСЦ-а задржава се и на онтогенези - због њихове константне миграције долази до трајног обнављања базена имунокомпетентних ћелија. Способност ГСК миграције, пенетрације кроз баријере крвном-ткива, имплантације раста ткива и цлоногениц пружио основу за ћелије коштане сржи у низу болести повезаних са поремећајима хемопоиетиц система.

Као и сви ћелија ресурса матичних, хематопоезе матичне ћелије су присутне у вашем ниша (коштане сржи) у веома малим количинама, што доводи до одређених потешкоћа у њиховој расподјели. Иммунопхенотипиц људски ХСЦС се окарактерисати као ЦД34 + НК ћелијама које су способне да пређе у крвоток и колонизује органе имуног система или насели строму коштане сржи. Неопходно је јасно схвати да ГСК није највише незреле ћелије коштане сржи, а изведене су из прекурсора, које укључују дормантние фибробласта СБ34-негативне ћелије. Утврђено је да су ћелије са фенотип ЦД34 могу да уђу у крвоток, где промене своју фенотип у ЦД34 +, али миграције повратак у коштаној сржи под утицајем микро околини поново постати елементи матичних ћелија ЦД34-негативна. У мировању, ЦД34-ћелије не реагују на паракрине регулаторне стромалне сигнале (фактори раста, цитокини). Међутим, у ситуацијама које захтевају појачавање интензитета хематопоетске матичне ћелије са фенотип ЦД34 одговори на диференцијација сигнале са обје хематопоезе и мезенхимална родитељских ћелија. Хематопоеза врши директним контактом са ГСК целуларним елементима строме коштане сржи представља сложену мрежу макрофага, ретикуларну ендотелне ћелије, остеобласта, стромалних фибробласта и екстрацелуларног матрикса. Коштана срж стромалног фрамеворк - не само матрица или "скелет" за хематопоезе ткиву, носи фину регулацију хематопоезе услед паракриних регулаторним сигналима фактора раста, цитокина и хемокина, а такође обезбеђује адхезивне интеракција неопходне за формирање крвних зрнаца.

Дакле, основа стално ажурираног система хемопоезе је хемопоетска матична ћелија, која је способна за продужено само-одржавање. Током процеса извршења, ХСЦ подлежу примарној диференцијацији и формирају клоне ћелија које се разликују у њиховим цитоморфолошким и имунофенотипним карактеристикама. Консекутивно формирање примитивних и посвећених прогениторских ћелија завршава се формирањем морфолошки препознатљивих предака ћелија различитих хематопоетских линија. Резултат комплекса вишестепене процесу каснијим фазама је сазревање хематопоетских ћелија и приноса зреле да периферне крви формиране елемената - еритроцити, леукоцити, лимфоцита и тромбоцита.

[1], [2], [3], [4], [5]

Извори хематопоетских матичних ћелија

Хематопоетске матичне ћелије сматрају се најизучаванији матичних извор, који је углавном због њихове употребе у клиници трансплантације коштане сржи. На први поглед, пуно је познато о овим ћелијама. У извесној мери ово важи, јер средњи и зреле потомци ГСК - Најповољније ћелијске елементе, од којих сваки (еритроцити, леукоцити, лимфоцити, моноцити / макрофаге и тромбоцити) су темељно изучавају на свим нивоима - од светлости да електронске микроскопије, фром биохемијске и имунофенотипске карактеристике пре идентификације помоћу ПЦР анализе. Међутим, праћење врше морфолошких, Ултраструктурне, биохемијске, иммунопхенотипиц, и биофизичким параметара геномске ГСК није дала одговоре на многа проблематична питања, решење које је неопходно за развој трансплантације ћелија. Још увијек није успостављен стабилизације механизме ГСК у успаваном стању, они су активиране, унесите фазу симетричне или асиметричне подели и најважније - посвећености васпитања као функционално различитих крвних ћелија, еритроцити, леукоцити, лимфоцити и тромбоцита.

Присуство у коштане сржи са фенотип ЦД34, који су преци оба месенхималне и хематопоезних матичних ћелија је покренуо питање постојања најранијих недалеко ЦД34-негативних ћелија у диференцијацију матичних ћелија и хематопоезе строме линије. Продужена култивациони метод је добијен тзв дугорочној културе "покретања 'ћелије (дугорочну културе-иницирајући ћелију - ЛТЦ-ИЦ). Животни век таквих родитељских ћелија у колонији формирајући активност коштане сржи строме на основу комбинације фактора раста је више од 5 недеља, док одрживост извршених јединица које формирају колоније (ЦФУ) у култури само 3 недеље. Ит ис цуррентли верује да ЛТЦ-ИЦ - функцијски аналог ГЦВ као репопулиатсионном при високим потенцијалом од око 20% ЛТЦ-ИЦ карактерише фенотипом ЦД34 + ЦД38- и показују висок капацитет за само-обнављање. Такве ћелије се налазе у сржи људској коштаној са фреквенцијом 1:50 000. Међутим, треба препознати лимфоидоинитсиируиусцхие-мијелоидне ћелије најближа ХСЦ које се добијају под условима дугорочне (15 недеља) културе. Овакве ћелије су означени као ЛТЦ међу сржи људске кости налазе се 10 пута мање од ЛТЦ-ИЦ, и формира као мијелоидне ћелијским линијама и лимфног хемопоиетиц стаблу.

Иако хематопоетских матичне ћелије означавање са моноклоналним антителима, затим идентификације иммунопхенотипиц је главни метод за идентификацију и селективни сортирање хематопоетских матичних ћелија са потенцијалним клиничке употребе наменског ГСК стога ограничена. Блокирање ЦД34 антитела рецепторе или друге маркер антигени током сортирања имунопозитивних неминовно мења особине ћелија изолованих са њим. Још пожељније је имуно-негативна секреција ХСЦ на магнетним стубовима. Међутим, у овом случају, сортирање се обично користи моноклонална антитела, фиксне на неком носачу метала. Такође је важно и начин расподјеле ГСК основу фенотипских, него функционалним карактеристикама. Стога, многи истраживачи више воле да користе анализу цлоногениц параметара ГСК, што омогућава величину и састав колонија за одређивање степена зрелости и правца диференцијације родитељских ћелија. Познато је да у процесу извршења број ћелија и број типова у колонијама се смањује. Хематопоезе матичних ћелија и њена ћерка ћелија рано назван "гранулоцита-еритроцитног моноцита-мегакариотситоколониеобразуиусцхаиа унит" (СФУ-ГЕММ), стварање културе Мултилинеар велике колоније које садрже, респективно, гранулоцита, еритроците, моноците и мегакариоцита. Налази испод линије гранулоцита линеаге обавеза монотситоколониеобразуиусцхаиа јединици (СФУ-ГМ) генерише колоније гранулоцита и макрофага, и Гранулоцитни јединице колонија формираних (СФУ-г) - само малим колонијама зрелих гранулоцита. Еарли еритроцита претходник - бурстообразуиусцхаиа јединица еритроцита (СФУ-Е) - представља извор великог и зрелије црвено крвно Стварање колоније у јединици (СФУ-Е) - црвених крвних колонија. У општој популацији, уз раст ћелија у получврстих медијима могу идентификовати ћелије формирају шест врста мијелоидне колонија: СФУ-ГЕММ, ГМ-СФУ, СФУ-Г, М-СФУ, ВФУ-Е и Е-СФУ).

Међутим, поред хематопоетских деривата, било који изворни материјал за одвајање ХСЦ садржи значајан број пратећих ћелија. У вези с тим, неопходно је прелиминарно пречишћавање трансплантата, пре свега, активних ћелија имуног система донатора. Обично се користи имуносупција заснована на експресији лимфоцита специфичних антигена, што омогућава да се изолују и уклоне помоћу моноклонских антитела. Осим тога, техника иммунорозетоцхнаиа Т-лимфоцита испражњена Боне Марров Трансплант, која се заснива на формирању комплекса ЦД4 + лимфоцита и специфични моноклоналних антитела ефикасно уклонити коришћењем афереза. Ова техника обезбеђује пречишћени ћелијски материјал са 40-60% хематопоетских матичних ћелија.

Повећање броја родитељских ћелија услед уклањања зрелих крвних ћелија из леукапхересис производа је постигнуто са супротносмерном центрифугирањем а затим филтрацијом (у присуству хелатора - тринатријум цитрат) кроз колону која садржи најлонских влакана обложених хуманог имуноглобулина. Секвенцијална употреба ових две технике обезбеђује комплетну чишћење трансплантата из крвних плочица 89% - на еритроцита и 91% - са леукоцита. Због значајног смањења ХСЦ губитака, ниво ЦД34 + ћелија у укупној ћелијској маси може се повећати на 50%.

За функционалне карактеристике изолованих хематопоетских матичних ћелија користи се њихова способност стварања колонија зрелог крвних елемената у култури. Анализа формираних колонија омогућава идентификацију и квантификацију типова прогениторских ћелија, степен њиховог вршења и утврђивање правца њихове диференцијације. Цлоногениц активност се одређује у получврстог медијима, метилцелулоза, агар, плазма или фибрин гелу, миграције ћелија активност смањења, спречавање своју приврженост ка површини стакла или пластике. У оптималним условима културе, клонови из једне ћелије развијају се у року од 7-18 дана. Ако у клону има мање од 50 ћелија, идентификује се као један кластер, ако број ћелија прелази 50 - као колонија. Број ћелија способних за формирање колонија (јединице за формирање колонија - ЦФУ или ћелија за формирање колонија - ЦОЦ) узима се у обзир. Треба напоменути да су параметри и ЦФУ ЦОЦ не одговарају броју ХСЦ у ћелијске суспензије, иако корелацији с тим поново наглашава потребу да идентификује функционалне (које формирају колоније) активност ХСЦС ин витро.

Међу ћелијама коштане сржи, хематопоетске матичне ћелије имају највећи пролиферативни потенцијал, због чега су највеће колоније формиране у култури. Према броју таквих колонија, предложено је да индиректно одреди број матичних ћелија. Након формирања колонија ин витро прелази 0,5 мм и са бројем ћелија 1000, аутори су тестирали стабилности ових ћелија да сублеталног дозе 5-флуороурацила и испитан њихову способност да насели коштане сржи смртно озрачених животиње. Према овим параметрима, изоловане ћелије нису се много разликовале од ХСЦ-а и добијале симбол ХПЦР-ЦФЦ-а - колоније формирајуће колоније са високим пролиферативним потенцијалом.

Трагање за могућношћу квалитетнијег избора хематопоетских матичних ћелија наставља се. Међутим, хематопоетске матичне ћелије морфолошки сличне лимфоцита и релативно уједначен збирка ћелија са скоро округлим језгра, хроматином и партикуларни слабобазофилнои малом количином цитоплазме. Тачан број је такође тешко одредити. Претпоставља се да се ГСК у коштаној сржи особе јавља са учесталошћу од 1 на 106 ћелија које садрже језгро.

Идентификација хематопоетских матичних ћелија

Да би се побољшала идентификација хематопоетских матичних ћелија врши секвенцијално или симултано (на вишеканалног сорбитан тере) истраживачку мембранносвиазанних спектра антигена, где ГСК фенотип ЦД34 + ЦД38 треба комбиновати са недостатком маркера диференцијације линеарних, нарочито антигена имунокомпетентних ћелија, као што су ЦД4 и површинских имуноглобулина гликопхорин.

Практично сви програми фенотипизације хематопоетских матичних ћелија укључују одређивање ЦД34 антигена. Овај гликопротеин са молекулском масом од око 110 кДа, који носе неколико гликозилације експримиран на плазми ћелијској мембрани након активације гена локализованог на хромозому 1. Молекули ЦД34 функција везаних за Л-селектинопосредованним интеракције раних хематопоетских родитељских ћелија из коштане сржи строме основи. Међутим, треба имати на уму да присуство ЦД34 антиген на површини ћелије дозвољава само направити прелиминарну процену садржаја ГСК у ћелијске суспензије, као што је изражено, и друга хематопоетске родитељских ћелија и коштане сржи строме ћелије и ендотелијалне ћелије.

Током диференцирања хематопоетских прогениторских ћелија, експресија ЦД34 је трајно смањена. Еритроцит, гранулоцит и моноцит завели прогениторске ћелије или слабо изражавају ЦД34 антиген, или уопште није присутан на њиховој површини (фенотип ЦД34). На површинској мембрани диференцираних ћелија коштане сржи и зрелог крвних зрнаца, ЦД34 антиген није детектован.

Треба напоменути да у динамици диференцијације хематопоетских родитељских ћелија не само да смањује ниво експресије ЦД34, али паралелно прогресивно повећану експресију ЦД38 антигена - интегрални мембрански гликопротеин молекулске масе од 46 кДа има НАД-гликогидролазнои и АДП-рибозил циклазе, указује на њену укљученост у транспорту и синтези АДП-рибозе. Стога, могуће је да удвостручи проверу степена посвећености хематопоетских стем ћелија. Популација ћелија са фенотипом ЦД34 + ЦД38 +, од 90 до 99% коштане сржи ЦД34-позитивне обухвата родитељских ћелија са ограниченом пролиферативних потенцијалне и диференцијацији, док са фенотипом ЦД34 + ЦД38 ћелије може тврдити улогу ГСК.

Заиста, становништво коштане сржи, описао формулом ЦД34 + ЦД38-, садржи релативно велики број примитивних матичних ћелија способних да диференцирају у мијелоидне и лимфним линијама. У контексту дугорочног култивацији са фенотип ЦД34 + ЦД38- ћелија успевају да свим зреле крвне ћелије: неутрофила, еозинофила базофили, моноците, мегакариоцита, еритроците и лимфоците.

Релативно недавно открили да ЦД34-позитивне ћелије експримирају још два маркер - АЦ133 и ЦД90 (Тхи-1), који се такође користи за идентификацију хематопоетске матичне ћелије. Тхи-1 антиген се заједно изражена са рецептором ЦД117 (ц-кит) на ЦД34 + ћелијама коштане сржи, кабл и периферне крви. Ова фосфатидилинозитолсвиазиваиусцхи површина гликопротеин молекулске тежине 25-35 кДа који је укључен у ћелијски адхезиони процесима. Неки аутори сматрају да је Тхи-1 антиген маркер најнезвучнијих ЦД34-позитивних ћелија. Саморепективне ћелије са фенотипом ЦД34 + Тхи-1 + дају дуготрајне линије са формирањем ћерке ћелије. Предлаже се да Тхи-1 антиген блокира регулаторне сигнале који доводе до заустављања дељења ћелија. Упркос чињеници да ЦД34 + Ту1 + ћелије су способне да само-обнове и стварања дугорочних култивисаним линије, њихова фенотип не може односити само на ХСЦ, ас Тхи-1 + садржај у укупне тежине елемената ћелија ЦД34-позитивне износи око 50%, далеко премашен број хематопоетских ћелија.

Више обећавајући за идентификацију хематопоетских матичних ћелија је АЦ133, антиген маркер за ћелије прекурсора хематопоезе, чија је експресија први пут откривена на ћелијама ембрионалних ћелија јетре. АЦ133 је трансмембрански гликопротеин који се појављује на површини ћелијске мембране у најранијим фазама сазревања ГСК - могуће је чак и раније од антигена ЦД34. У студијама А. Петренка и В. Грисхцхенка (2003) установљено је да АЦ133 изражава до 30% ЦД34-позитивних ћелија ембрионалног јетре.

Стога, идеалан профил фенотипске хематопоетских матичних ћелија данас концептима, збир ћелија нацрта, у кола која мора бити присутна ЦД34 антигена конфигурацији, АЦ133 и Тхи-1 али нема места за молекуларне пројекција ЦД38, ХЛА-ДР и маркери линеар диференцијација ГПА , ЦД3, ЦД4, ЦД8, ЦД10, ЦД14, ЦД16, ЦД19, ЦД20.

ГСК фенотипска варијације портрет може бити комбинација ЦД34 + ЦД45РаловЦД71лов, јер својства ћелија описаних овом формулом не разликују од функционалних параметара ћелија са фенотипом ЦД34 + ЦД38. Осим тога, људска ХСЦ могу бити идентификоване фенотипске знакова ЦД34 + Тхи-л + ЦД38Иов / 'ц-кит / ниска - само 30 ових ћелија у потпуности повратити хематопоезе у смртно озрачених мишева.

Из анализе општих фенотипских карактеристика коштане сржи заправо почела 40 година интензивног истраживања ГСК истовремено способне од обоје само-обнављање и диференцијације другим ћелијским елементима, омогућавајући оправдати употребу трансплантације коштане сржи у лечењу различитих патологија хемопоиетиц система. Недавно откривене нове врсте матичних ћелија још увек нису широко коришћене у клиничкој пракси. Међутим, матичних ћелија из пупчане врпце (врпце) Блоод анд јетри фетуса може значајно проширују Трансплантација ћелија не само у хематологије, али иу другим областима медицине, као различите од ХСЦ коштане сржи као квантитативних карактеристика перформанси и квалитета.

Дисплацемент масс целл хематопоезе стем неопходно за трансплантацију се генерално добијају из коштане сржи, периферне и врпце, као ембрионалног јетре. Поред тога, хематопоетске прогениторне ћелије се могу добити ин витро пропагирање ЕСЦ и њихова каснија разлика у хематопоезе циљане ћелијске елементе. О Петренко В. Грисхцхенко (2003) с правом истичу значајне разлике имунолошке особине и способности да се обнови хематопоезе ГСК другачије порекло, због неједнаке однос садржане у њиховим изворима плурипотентне рано и касније почињених предака. Надаље, хематопоетске матичне ћелије, изведене из различитих извора стаблом, назначен квантитативно и квалитативно веома различита удружења нису хематопоетске ћелије.

Традиционални извор хематопоетских матичних ћелија је коштана срж. Суспензија ћелија коштане сржи се добија од абдоминалне кости или грудне кошнице изношењем у локалну анестезију. Тако добијена суспензија је хетерогена и садржи смешу ХСЦ, елементе стромалних ћелија, посвећене прогениторске ћелије миелоидних и лимфоидних линија, као и зреле крвне елементе. Број ћелија са фенотипима ЦД34 + и ЦД34 + ЦД38 међу мононуклеарним ћелијама коштане сржи је 0,5 до 3,6 и 0 до 0,5%, респективно. Периферна крв након мобилизације изазване Г-ЦСФ ХСЦ садржи 0,4-1,6% ЦД34 + и 0-0,4% ЦД34 + ЦД38.

Већи проценат ћелија са ЦД34 + ЦД38 иммунопхенотипе и ЦД34 + врпце - и 0-0.6 ОД-2,6%, а њихов максимални број детектује код хематопоетске феталних ћелија јетре - и 2,3 0,2-12,5 -35,8%, респективно.

Међутим, квалитет калема материјала не зависи само од количине садржаног у њему ЦД34 + ћелија, већ и на њихову функционалну активност, која се могу одмерити нивоом формирања колонија у виво (сржи репопулацији у смртно озрачених животињама) и ин витро - раста колонија на получврстих медијима . Утврђено је да је колонија формирања и пролиферативна активност хемопоиетиц родитељских ћелија са фенотипом ЦД34 + ЦД38 ХЛА-ДР, изоловане из феталне јетре, феталне коштаној сржи и крви из пупчаника, и увелико превазилази пролиферативног капацитета хематопоетичних које формирају колоније ћелијама коштане сржи и периферне крви одрасле особе. Квантитативна и квалитативна анализа ГСК различитог порекла открила значајне разлике у њиховим релативног садржаја у суспензији ћелија, и функционалности. Максималан број ЦД34 + ћелија (24.6%) примећени у графта материјалима изведеним из фетуса коштане сржи. Коштана срж одрасле особе садржи 2,1% ЦД34-позитивних ћелијских елемената. Међу мононуклеарних ћелија хуманог одраслих периферне крви само 0,5% има фенотип ЦД34 +, док крв из пупчане врпце њихов износ достиже 2%. Тако формирају колоније способност ЦД34 + ћелија фетуса коштане сржи за 2,7 пута премашује капацитете клонској раста хематопоезе коштане сржи одраслих људских ћелија и крви из пупчаника ћелије формирају значајно веће колоније него хематопоетским елемената изолованих из периферне крви одраслих: 65,5 до 40 и , 8 колонија / 105 ћелија, респективно.

Разлике у пролиферативна активност и способности хематопоиетиц матичних ћелија које формирају колоније су повезани не само са различитим степеном зрелости, али и њиховом природном микро-окружењу. Познато је да је интензитет пролиферације и диференцијације матичних ћелија брзине одређене према интегралном регулаторног утицаја мулти-компонентни систем фактора раста и цитокина који су произведени од стране оба матичних ћелија и ћелијских елемената матрикс-стромал микроокружења. Користећи пречишћене ћелијске популације и медијумом без серума са погледом на ћелијске културе дајући назначен факторе раста који имају стимулативни и инхибиторне ефекте на матичним ћелијама различитих нивоа, родитељских ћелија и ћелија учињених у одређеном линеарном правцу. Резултати изведених студија убедљиво потврђују да се ГСК, добивени из извора различитих нивоа онтогенетског развоја, разликују и фенотипски и функционално. За ГСК, остаје у ранијим фазама онтогенезе, одликује се високим потенцијалом за самопродукцију и високом пролиферативном активношћу. Такве ћелије се одликују дужом дужином теломера и подвргавају се настанку са формирањем свих хематопоетских ћелијских линија. Реакција имуног система на ХСЦ ембрионално порекло је одложена, јер такве ћелије благе експресије ХЛА молекула. Постоји јасна градација релативног садржаја ХСЦС и њихова способност да самостално обнови и број линија формирају врста посвећености: ЦД34 + ћелије јетри фетуса> ЦД34 + ћелије пупчане врпце> ЦД34 + ћелијама коштане сржи. Важно је да такве разлике нису јединствене за Интра- и нео постанаталному рани период људског развоја, али и током онтогеније - антипролиферативној и које формирају колоније активност ХСЦС изведени из коштане сржи или периферне крви одрасле особе, обрнуто сразмерно старости донатора.