Неуралне матичне ћелије

Експериментални докази о могућности регенерације ћелија ЦНС-а добијени су много раније од открића ембрионалних матичних ћелија у студијама које су показале присуство ћелија у неокортексу, хипокампусу и олфакторним булусима мозга одраслих пацова које хватају 3H-тимидин, тј. способне су за синтезу протеина и деобу. Још 60-их година прошлог века претпостављало се да су ове ћелије прекурсори неурона и да су директно укључене у процесе учења и памћења. Нешто касније откривено је присуство синапси на неуронима формираним de novo и појавили су се први радови о употреби ембрионалних матичних ћелија у сврху индуковања неурогенезе in vitro. Крајем 20. века, експерименти са усмереном диференцијацијом ембрионалних матичних ћелија у неуронске ћелије-прогениторе, допаминергичке и серотонергичке неуроне довели су до ревизије класичних идеја о способности нервних ћелија сисара да се регенеришу. Резултати бројних студија убедљиво су доказали и стварност реструктурирања неуронских мрежа и присуство неурогенезе током целог периода постнаталног живота организма сисара.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Извори неуралних матичних ћелија

Људске неуралне матичне ћелије се изолују током операција на субвентрикуларном региону латералних комора и дентатном гирусу хипокампуса, чије ћелије у култури формирају неуросфере (нервне сфере), а након дисперзије и преформирања ових последњих - све главне типове ћелија централног нервног система или, у посебној подлози, нове микросфере. У суспензионим културама дисоцираног ткива изолованог из перивентрикуларних региона ембрионалног мозга, такође настају неуросфере.

Маркери незрелих можданих ћелија укључују нестин, бета-тубулин III (маркер неуронске лозе), виментин, GFAP и NCAM, који се идентификују имуноцитохемијски коришћењем моноклонских антитела. Нестин (интермедијарни неурофиламентни протеин типа IV) експресују мултипотентне неуроектодермалне ћелије. Овај протеин се користи за идентификацију и изолацију мултипотентних неуроепителних прогениторских ћелија из ЦНС-а коришћењем моноклонских антитела Rat-401, која могу да детектују до 95% ћелија неуралне цеви код ембриона пацова једанаестог дана гестације. Нестин се не експресује на диференцираним потомцима неуралних матичних ћелија, али је присутан у раним неуралним прогениторским ћелијама, постмитотским неуронима и раним неуробластима. Овај маркер је коришћен за идентификацију неуроепителних прогениторских ћелија и за доказивање постојања матичних ћелија у ЦНС-у. Виментин (интермедијарни неурофиламентни протеин типа III) експресују неуралне и глијалне прогениторске ћелије, као и неурони, фибробласти и ћелије глатких мишића. Стога, оба имуноцитохемијска маркера немају специфичност потребну за одвојену идентификацију неуралних матичних и прогениторских ћелија. Бета-тубулин III успоставља неуронски правац диференцијације матичних ћелија, док се астроцити типа I идентификују експресијом GFAP-а, а олигодендроцити специфично експресују галактоцереброзид (Ga!C).

ФГФ2 и ЕГФ служе као митогени за неуронске прогениторске ћелије, подржавајући пролиферацију недиференцираних прогениторских ћелија у култури са формирањем неуросфера. Брзина деобе неуралних матичних ћелија значајно се повећава под утицајем ФГФ2, као и уз употребу комбинације ФГФ2 + ЕГФ. Пролиферативни ефекти ФГФ2 су посредовани ФГФ2-Р1 рецепторима. Хепарин повећава афинитет везивања за ФГФ2 рецептор и драматично појачава његов митогени ефекат на неуроепителне ћелије. У раним фазама ембриогенезе, ФГФ2 рецептори се експресују у теленцефалону пацова, док је у каснијим фазама њихова локализација ограничена на вентрикуларну зону. Врхунац експресије ФГФ2-Р1 од стране постмитотских ћелија се примећује по завршетку периода раног неурогенезе. Почетни период развоја теленцефалона карактерише низак ниво експресије ЕГФ рецептора, углавном у ћелијама вентралног региона. У каснијим фазама ембриогенезе, експресија ЕГФ-Р се повећава у дорзалном смеру. У мозгу глодара, EGF има висок афинитет за рецептор трансформишућег фактора раста бета (TGF-бета-R), за који се преференцијално везује. Индиректни докази за функционалну улогу EGF-R пружају се подацима о кортикалној дисгенези предњег мозга која се јавља у касном периоду ембриогенезе и постнаталне онтогенезе, смањеној функцији предњег мозга, смрти кортикалних ћелија и ектопији хипокампуса код мишева са нокаутом гена EGF рецептора. Поред тога, присуство TGF-α у хранљивој подлози је апсолутно неопходно за формирање неуросфера. Након уклањања фактора раста из условљене подлоге, ћелије престају да се деле и подлежу спонтаној диференцијацији са формирањем неурона, астроцита и олигодендробласта.

Узимајући ово у обзир, реагрегација дисоцираних матичних ћелија и култивација неуросфера се спроводе у хранљивим медијумима који садрже EGF и базни FGF или FGF2, али без додавања серума. Показано је да EGF индукује пролиферацију матичних ћелија субепендималне зоне латералних комора, а базни FGF промовише пролиферацију матичних ћелија стријатума, хипокампуса, неокортекса и оптичког нерва зрелог мозга. Комбинација EGF и базног FGF је апсолутно неопходна за активну пролиферацију матичних ћелија изолованих из епендима треће и четврте коморе предњег мозга, као и из кичменог канала грудног и лумбалног дела кичмене мождине.

Након дисоцијације, суспензија неуронских матичних ћелија се култивише у пластичним посудама или плочама са више бунара без адхезивне подлоге како би се повећала величина новоформираних неуросфера, што обично траје око 3 недеље. Метода вишеструке дисперзије и репродукције неуросфера омогућава добијање довољног броја линеарних клонова мултипотентних матичних ћелија за интрацеребралну трансплантацију. Овај принцип је такође основа за стварање банке матичних ћелија изолованих из људског ембрионалног мозга. Њихово дугорочно (током неколико година) клонирање омогућава добијање стабилних линија неуронских матичних ћелија, из којих се током индуковане диференцијације формирају катехоламинергички неурони.

Ако се неуросфере не диспергују и не расту на адхезивним подлогама у медијумима којима недостају фактори раста, пролиферирајуће матичне ћелије почињу спонтано да се диференцирају и формирају неуронске и глијалне прекурсорске ћелије које експримирају маркере свих врста нервних ћелија: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, бета-тубулин III (неурони), GFAP (астроцити) и CalC, 04 (олигодендроцити). За разлику од ћелија миша и пацова, неурони чине више од 40% свих диференцираних ћелија у културама људских неуралних матичних ћелија (од 1 до 5% код глодара), али се формира знатно мање олигодендроцита, што је веома важно са становишта ћелијске терапије демијелинизирајућих болести. Проблем се решава додавањем подлоге за култивацију B104, која стимулише формирање ћелија које производе мијелин.

Приликом култивације неуронских прогениторских ћелија из мозга људских ембриона у медијуму који садржи EGF, базни FGF и LIF, број прекурсорских ћелија неуралне лозе се повећава 10 милиона пута. Ћелије умножене in vitro задржавају способност миграције и диференцијације у неуралне и глијалне елементе након трансплантације у мозак зрелих пацова. Међутим, in vivo је број деоба мултипотентних прекурсорских ћелија ограничен. Више пута је примећено да је Хејфликова граница за „одраслу“ неуронску матичну ћелију (око 50 митоза) још увек недостижна чак ни у експерименту - ћелије у облику неуросфера задржавају своја својства само 7 месеци и тек након 8 пасажа. Верује се да је то због особености њихових метода дисперзије током пасажа (трипсинизација или механичко дејство), што нагло смањује пролиферативну активност ћелија због поремећаја међућелијских контаката. Заиста, ако се уместо дисперзије користи метода поделе неуросфера на 4 дела, виталност ћелија током пасажа значајно се повећава. Ова метода омогућава култивацију људских неуронских матичних ћелија током 300 дана. Међутим, након овог периода ћелије губе митотску активност и подлежу дегенерацији или улазе у фазу спонтане диференцијације са формирањем неурона и астроцита. На основу тога, аутор сматра да је 30 митоза максималан број подела за култивисане неуралне матичне ћелије.

Када се људске неуралне матичне ћелије култивишу in vitro, претежно се формирају ГАБАергички неурони. Без посебних услова, неуралне прогениторске ћелије дају допаминергичке неуроне (неопходне за ћелијску терапију Паркинсонове болести) само у првим пасажима, након чега се сви неурони у култури састоје искључиво од ГАБАергичких ћелија. Код глодара, IL-1 и IL-11, као и фрагменти мембрана нервних ћелија, LIF и GDNF, изазивају индукцију допаминергичких неурона in vitro. Међутим, овај методолошки приступ се показао неуспешним код људи. Ипак, када се ГАБАергички неурони трансплантирају интрацеребрално in vivo, под утицајем фактора микроокружења, настају нервне ћелије са различитим медијаторским фенотиповима.

Потрага за комбинацијама неуротрофичних фактора показала је да FGF2 и IL-1 индукују формирање допаминергичких неуробласта, који, међутим, нису способни да производе допаминергичке неуроне. Диференцијација матичних ћелија хипокампуса у ексцитаторне глутаматергичке и инхибиторне GABA-ергичке неуроне одвија се под утицајем неуротрофина, а EGF и IGF1 индукују формирање глутаматергичких и GABA-ергичких неурона из неуронских ћелија прогенитора људских ембриона. Секвенцијално додавање ретиноинске киселине и неуротрофина 3 (NT3) у културу значајно повећава диференцијацију зрелих матичних ћелија хипокампуса мозга у неуроне различите природе медијатора, док комбинација неуротрофичног фактора изведеног из мозга (BNDF), NT3 и GDNF може произвести пирамидалне неуроне у културама хипокампуса и неокорикта.

Дакле, резултати бројних студија указују да су, прво, матичне ћелије из различитих можданих структура под утицајем локалних специфичних ткивних фактора способне да се in vivo диференцирају у неуронске фенотипове својствене тим структурама. Друго, циљана индукована диференцијација неуралних матичних ћелија in vitro коришћењем клонирања ћелија прогенитора омогућава добијање нервних и глијалних ћелија са одређеним фенотипским карактеристикама за интрацеребралну трансплантацију код различитих облика патологије мозга.

Нема сумње да се плурипотентне матичне ћелије изоловане из ембриона или одраслог ЦНС-а могу сматрати извором нових неурона и користити у клиници за лечење неуролошке патологије. Међутим, главна препрека развоју практичне ћелијске неуротрансплантације је чињеница да се већина неуронских матичних ћелија не диференцира у неуроне након имплантације у ненеурогене зоне зрелог ЦНС-а. Да би се заобишла ова препрека, предложена је веома оригинална иновативна метода која омогућава ин витро добијање чисте популације неурона из људских феталних неуронских матичних ћелија након трансплантације у ЦНС зрелог пацова. Аутори доказују да се диференцијација ћелија имплантираних овом методом завршава формирањем неурона холинергичког фенотипа, што је последица утицаја фактора околног микроокружења. Предложена технологија је интересантна са становишта развоја нових врста терапије засноване на матичним ћелијама и замене неурона оштећених услед повреде или неуродегенеративних болести, будући да холинергички неурони играју водећу улогу у развоју моторичких, меморијских и функција учења. Конкретно, холинергички неурони изоловани из људских матичних ћелија могу се користити за замену моторних неурона изгубљених услед амиотрофичне латералне склерозе или повреда кичмене мождине. Тренутно нема информација о методама за производњу значајног броја холинергичких неурона из популације митогеном преформираних матичних ћелија. Аутори предлажу прилично једноставан, али ефикасан метод за стимулацију митогеном преформираних примарних људских ембрионалних неуронских матичних ћелија да се развију у практично чисте неуроне након имплантације у неурогене и неурогене зоне ЦНС-а зрелог пацова. Најважнији резултат њиховог рада је конверзија довољно великог броја трансплантираних ћелија у холинергичке неуроне када се имплантирају у средњу мембрану и кичмену мождину.

Поред тога, за преформирање неуралних матичних ћелија из 8-недељне људске ембрионалне мождане коре у холинергичке неуроне in vitro, предлаже се коришћење различитих комбинација следећих трофичких фактора и хемијских елемената: рекомбинантни базни FGF, EGF, LIF, мишји амино-терминални звучни пептид (Shh-N), транс-ретиноинска киселина, NGF, BDNF, NT3, NT4, природни ламинин и мишји хепарин. Оригинална линија људских неуралних матичних ћелија (K048) одржавана је in vitro две године и издржала је 85 пасажа без промена у пролиферативним и диференцијационим својствима, уз одржавање нормалног диплоидног кариотипа. Недисперговане неуросфере пасажа 19–55 (недеље 38–52) су посејане на поли-d-лизин и ламинин, а затим третиране горе поменутим факторима у различитим концентрацијама, комбинацијама и секвенцама. Комбинација базног FGF, хепарина и ламинина (скраћено FHL) дала је јединствен ефекат. Након једног дана култивације ембрионалних неуралних матичних ћелија у FHL медијуму са или без Shh-N (комбинација Shh-N + FHL у скраћеници SFHL), примећена је брза пролиферација великих планарних ћелија. Сви остали једнодневни протоколи (као што је базични FGF + ламинин), напротив, довели су до ограниченог радијалног ширења вретенастих ћелија, а ове ћелије нису напуштале језгро неуросфера. Након 6 дана активације и накнадних 10 дана диференцијације у медијуму који садржи B27, велике мултиполарне ћелије сличне неуронима су детектоване на ивици FHL-активираних сфера. У другим протоколарним групама, већина ћелија сличних неуронима је остала мала и биполарна или униполарна. Имуноцитохемијска анализа је показала да су мале (< 20 μm) биполарне или униполарне ћелије биле или GABAергичке или глутаматергичке, док је већина великих мултиполарних ћелија локализованих на ивици FHL-активираних неуросфера била холинергичка, експресујући маркере карактеристичне за холинергичке неуроне (Islet-1 и ChAT). Неки од ових неурона су истовремено експресовали синапсин 1. Као резултат пет серија независних експеримената, аутори су открили да се укупна популација ћелија у једнослојним зонама диференцирала у TuJ1+ неуроне за 45,5%, док су холинергички (ChAT^) неурони чинили само 27,8% ћелија исте популације. Након 10 дана додатне диференцијације in vitro, поред холинергичких неурона, у FHL-активираним неуросферама пронађен је значајан број малих неурона - глутаматергички (6,3%), GABA-ергички (11,3%), као и астроцити (35,2%) и нестин-позитивне ћелије (18,9%). Приликом коришћења других комбинација фактора раста, холинергички неурони су били одсутни, а маргиналне ћелије неуросфера су формирале или астроците или мале глутаматергичке и ГАБА-ергичке неуроне. Праћење резервних и активних потенцијала коришћењем технике „patch clamp“ целог ћелијског теста показало је да је након седам дана активације FHL, већина великих полиполарних ћелија имала потенцијал мировања од -29,0±2,0 mV у одсуству акционог потенцијала. После 2 недеље, потенцијал мировања се повећао на -63.6±3,0 mV, а акциони потенцијали су примећени у тренутку индукције деполаризујућих струја и блокирани су помоћу 1 M тетродотоксина, што указује на функционалну активност холинергичких незрелих неурона.

Аутори су даље утврдили да активација FHL или SFHL in vitro per se не доводи до формирања зрелих неурона и покушали су да утврде да ли су матичне ћелије претходно формиране помоћу FHL или SFHL способне да се диференцирају у холинергичке неуроне када се трансплантирају у ЦНС зрелих пацова. У ту сврху, активиране ћелије су убризгане у неурогену зону (хипокампус) и у неколико не-неурогених зона, укључујући префронтални кортекс, средњу мембрану и кичмену мождину одраслих пацова. Имплантиране ћелије су праћене помоћу CAO-^^p вектора. Познато је да OCP обележава и ћелијску ултраструктуру и ћелијске процесе (молекуларни ниво) без цурења и може се директно визуализовати. Поред тога, OCP-ом обележене неуралне матичне ћелије одржавају профил неуронске и глијалне диференцијације идентичан профилу нетрансформисаних матичних ћелија ембрионалног мозга.

Једну до две недеље након имплантације 5 x 10⁴ ^{активираних} и обележених неуралних матичних ћелија, оне су пронађене у кичменој мождини или мозгу пацова, при чему су се OCD+ ћелије налазиле углавном близу места ињекције. Процеси миграције и интеграције примећени су већ месец дана након трансплантације. Границе миграције варирале су у зависности од места ињекције: када су убризгане у префронтални кортекс, OCD+ ћелије су се налазиле 0,4-2 мм од места ињекције, док су у случају имплантације у средњу мембрану, хипокампус или кичмену мождину, ћелије мигрирале на много веће удаљености - до 1-2 цм. Трансплантиране ћелије су биле локализоване у високо организованим структурама ЦНС-а, укључујући фронтални кортекс, средњу мембрану, хипокампус и кичмену мождину. OCD-обележени неуронски елементи били су видљиви већ у првој недељи након трансплантације, при чему се њихов број значајно повећао месец дана након операције. Стереолошка анализа је показала већу стопу преживљавања имплантираних ћелија у различитим структурама мозга, у поређењу са кичменом мождином.

Познато је да је у већини ткива одраслог организма сисара очувана популација регионалних матичних ћелија, чију трансформацију у зреле ћелије регулишу специфични ткивни фактори. Пролиферација матичних ћелија, диференцијација ћелија прогенитора и формирање неуронских фенотипова специфичних за дату мождану структуру in vivo изражени су у много већој мери у ембрионалном мозгу, што је одређено присуством високих концентрација морфогенетских фактора локалног микроокружења - неуротрофина BDNF, NGF, NT3, NT4/5 и фактора раста FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Где се налазе неуралне матичне ћелије?

Утврђено је да неуралне матичне ћелије експресују глијални кисели фибриларни протеин, који се међу зрелим ћелијама неуралне лозе задржава само на астроцитима. Стога, астроцитне ћелије могу бити резерва матичних ћелија у зрелом ЦНС-у. Заиста, неурони који потичу од GFAP-позитивних прекурсора идентификовани су у олфакторним булбусима и дентатном гирусу, што је у супротности са традиционалним идејама о прогениторској улози радијалне глије, која не експресује GFAP у дентатном гирусу у одраслом добу. Могуће је да постоје две популације матичних ћелија у ЦНС-у.

Питање локализације матичних ћелија у субвентрикуларној зони такође остаје нејасно. Према неким ауторима, епендималне ћелије у култури формирају сферне клонове који нису праве неуросфере (као клонови субепендималних ћелија), јер су способне да се диференцирају само у астроците. С друге стране, након флуоресцентног или вирусног обележавања епендималних ћелија, маркер се детектује у ћелијама субепендималног слоја и олфакторних булбуса. Тако обележене ћелије in vitro формирају неуросфере и диференцирају се у неуроне, астроците и олигодендроците. Поред тога, показано је да око 5% ћелија у епендими експресује матичне маркере - нестин, Notch-1 и Mussashi-1. Претпоставља се да је механизам асиметричне митозе повезан са неравномерном расподелом мембранског рецептора Notch-1, услед чега овај други остаје на мембрани ћерке ћелије локализоване у епендималној зони, док је матична ћелија која мигрира у субепендимални слој лишена овог рецептора. Са ове тачке гледишта, субепендимална зона се може сматрати колектором прогениторских прекурсора неурона и глије формираних из матичних ћелија епендималног слоја. Према другим ауторима, у каудалним деловима субвентрикуларне зоне формирају се само глијалне ћелије, а извор неурогенезе су ћелије рострално-латералног дела. У трећој варијанти, предњим и задњим деловима субвентрикуларне зоне латералних комора дат је еквивалентан неурогени потенцијал.

Четврта варијанта организације матичне резерве у централном нервном систему делује пожељније, према којој се у субвентрикуларној зони разликују три главна типа неуронских ћелија прогенитора - А, Б и Ц. А-ћелије експресују ране неуронске маркере (PSA-NCAM, TuJl) и окружене су Б-ћелијама, које се идентификују као астроцити експресијом антигена. Ц-ћелије, немајући антигене карактеристике неурона или глије, имају високу пролиферативну активност. Аутор је убедљиво доказао да су Б-ћелије прекурсори А-ћелија и de novo неурона олфакторних булбуса. Током миграције, А-ћелије су окружене ланцима неуронских ћелија прогенитора, што се значајно разликује од механизма миграције постмитотских неуробласта дуж радијалне глије у ембрионалном мозгу. Миграција се завршава у олфакторним булбусима митотичком деобом и А и Б ћелија, чији се деривати уграђују у слојеве грануларних ћелија и у гломеруларни слој олфакторне зоне мозга.

Ембрионални мозак у развоју нема диференциране епендималне ћелије, а зидови комора садрже пролиферирајуће матичне ћелије вентрикуларне герминативне и субвентрикуларне зоне, где мигрирају примарни неуро- и глиобласти. На основу тога, неки аутори сматрају да субепендимални регион зрелог мозга садржи редуковано ембрионално герминативно нервно ткиво које се састоји од астроцита, неуробласта и неидентификованих ћелија. Праве нервне матичне ћелије чине мање од 1% ћелија у герминативној зони латералног вентрикуларног зида. Делимично из тог разлога, а такође и у вези са подацима да су астроцити субепендималне зоне прекурсори нервних матичних ћелија, није искључена могућност трансдиференцијације астроцитних глијалних елемената са стицањем неуронских фенотипских карактеристика.

Главна препрека коначном решењу проблема локализације неуралних матичних ћелија in vivo је недостатак специфичних маркера за ове ћелије. Ипак, са практичне тачке гледишта веома су интересантни извештаји да су неуралне матичне ћелије изоловане из региона ЦНС-а који не садрже субепендималне зоне - треће и четврте коморе предњег мозга, кичменог канала торакалног и лумбалног региона кичмене мождине. Од посебног значаја је чињеница да повреда кичмене мождине повећава пролиферацију епендималних матичних ћелија централног канала са формирањем прогениторских ћелија које мигрирају и диференцирају се у астроците глиомезодермалног ожиљка. Поред тога, прекурсорске ћелије астро- и олигодендроцита пронађене су и у неповређеној кичменој мождини одраслих пацова.

Дакле, подаци из литературе убедљиво показују присуство у ЦНС-у одраслих сисара, укључујући и човека, регионалне резерве стабљике, чији је регенеративно-пластични капацитет, нажалост, способан да обезбеди само процесе физиолошке регенерације са формирањем нових неуронских мрежа, али не задовољава потребе репаративне регенерације. То поставља задатак тражења могућности за повећање ресурса стабљике ЦНС-а егзогеним средствима, што је нерешиво без јасног разумевања механизама формирања ЦНС-а у ембрионалном периоду.

Данас знамо да су током ембрионалног развоја матичне ћелије неуралне цеви извор три типа ћелија - неурона, астроцита и олигодендроцита, односно неурони и неуроглија потичу из једне прекурсорске ћелије. Диференцијација ектодерма у кластере неуралних ћелија прогенитора почиње под утицајем производа пронеуралних гена породице bHLH и блокирана је експресијом деривата рецепторских трансмембранских протеина гена породице Notch, који ограничавају одређивање и рану диференцијацију неуралних ћелија прекурсора. Заузврат, лиганди Notch рецептора су трансмембрански Делта протеини суседних ћелија, због чијег екстрацелуларног домена се остварују директни међућелијски контакти са индуктивном интеракцијом између матичних ћелија.

Даља имплементација програма ембрионалне неурогенезе није ништа мање сложена и, чини се, требало би да буде специфична за врсту. Међутим, резултати студија неуроксенотрансплантације указују на то да матичне ћелије имају изражен еволутивни конзервативизам, због чега су људске неуралне матичне ћелије способне да мигрирају и развијају се када се трансплантирају у мозак пацова.

Познато је да ЦНС сисара има изузетно низак капацитет за репаративну регенерацију, што карактерише одсуство било каквих знакова појаве нових ћелијских елемената у зрелом мозгу који би заменили неуроне који су умрли као последица повреде. Међутим, у случају трансплантације неуробласта, ови последњи се не само прилагођавају, пролиферишу и диференцирају, већ су такође способни да се интегришу у мождане структуре и функционално замене изгубљене неуроне. Приликом трансплантације посвећених неуронских ћелија прогенитора, терапеутски ефекат је био знатно слабији. Показано је да такве ћелије имају низак капацитет за миграцију. Поред тога, неуронске ћелије прогенитор не репродукују архитектуру неуронских мрежа и нису функционално интегрисане у мозак примаоца. У том смислу, активно се проучавају питања репаративно-пластичне регенерације током трансплантације непреформираних мултипотентних неуронских матичних ћелија.

У студији М. Александрове и др. (2001), у првој верзији експеримената, примаоци су биле полно зреле женке пацова, а донори ембриони стари 15 дана. Примаоцима је уклоњен део окципиталног кортекса мозга, а у шупљину је трансплантирано механички суспендовано ткиво претпостављеног ембрионалног кортекса које садржи мултипотентне матичне ћелије вентрикуларних и субвентрикуларних региона. У другој верзији експеримената, неуралне матичне ћелије људског ембриона старог 9 недеља трансплантиране су у мозак полно зрелих пацова. Аутори су изоловали комадиће ткива из перивентрикуларног региона ембрионалног мозга, ставили их у хранљиву подлогу F-12 и добили ћелијску суспензију поновљеним пипетирањем, а затим их култивисали у посебној NPBM подлози са додатком фактора раста - FGF, EGF и NGF. Ћелије су гајене у суспензионој култури док се нису формирале неуросфере, које су дисперговане и поново посејане у културу. Након 4 пасажа са укупним периодом култивације од 12-16 дана, ћелије су коришћене за трансплантацију. Примаоци су били младунци пацова стари десет дана и полно зрели двомесечни Вистар пацови, којима је 4 μl суспензије људских неуралних матичних ћелија убризгано у латералну комору мозга без имуносупресије. Резултати рада су показали да су дисоциране ћелије вентрикуларне и субвентрикуларне зоне ембрионалног анлага мождане коре пацова наставиле свој развој током алотрансплантације у зрели мозак, тј. да фактори микроокружења диференцираног мозга реципијента нису блокирали раст и диференцијацију неуралних матичних ћелија ембриона. У раним фазама након трансплантације, мултипотентне ћелије су наставиле митотску деобу и активно мигрирале из подручја трансплантације у мождано ткиво реципијента. Трансплантиране ембрионалне ћелије са огромним миграционим потенцијалом пронађене су у скоро свим слојевима мождане коре реципијента дуж трансплантационог пута и у белој маси. Дужина миграционог тракта нервних ћелија је увек била знатно краћа (до 680 μm) од дужине глијалних елемената (до 3 mm). Крвни судови и влакнасте структуре мозга служили су као структурни вектори за миграцију астроцита, што је примећено и у другим студијама.

Раније се веровало да акумулација обележених астроцита у подручју оштећења мождане коре примаоца може бити повезана са формирањем глијалне баријере између ткива трансплантата и примаоца. Међутим, проучавање структуре компактно лоцираних ћелијских трансплантата показало је да њихову цитоархитектуру карактерише хаос, без икакве слојевите расподеле трансплантираних ћелија. Степен уређености трансплантираних неурона приближио се оном нормалних ћелија мождане коре само у одсуству глијалне баријере између ткива донора и примаоца. У супротном, структура трансплантираних ћелија била је атипична, а сами неурони су били подложни хипертрофији. Коришћењем неуроимунохемијског типизирања трансплантираних ћелија, у трансплантатима су пронађени инхибиторни ГАБА-ергички неурони и откривена је експресија PARV, CALB и NPY протеина. Сходно томе, зрели мозак задржава факторе микроокружења способне да подрже пролиферацију, миграцију и специфичну диференцијацију неуронских мултипотентних ћелија.

У култури људских матичних ћелија изолованих из перивентрикуларног региона мозга ембриона старих 9 недеља, М. Александрова и др. (2001) су пронашли велики број нестин-позитивних мултипотентних ћелија у четвртом пасажу, од којих су неке већ прошле ин витро диференцијацију и развијале су се према неуронском типу, што је одговарало резултатима студија других аутора. Након трансплантације у мозак одраслих пацова, култивисане људске матичне ћелије су се митотски поделиле и мигрирале у ткиво ксеногеног мозга реципијента. У ћелијским трансплантатима, аутори су посматрали две популације ћелија - мале и веће. Потоње су мигрирале и у паренхиму и дуж влакнастих структура мозга реципијента на безначајним растојањима - унутар 300 μм. Највећи обим путање миграције (до 3 мм) био је карактеристичан за мале ћелије, од којих су се неке диференцирале у астроците, што је утврђено коришћењем моноклонских антитела на GFAP. Оба типа ћелија пронађена су у зиду латералне коморе, што указује да су трансплантиране ћелије ушле у рострални миграциони тракт. Астроцитни деривати неуралних матичних ћелија и људи и пацова мигрирали су претежно кроз крвне капиларе и влакнасте структуре мозга примаоца, што се поклапа са подацима других аутора.

Анализа диференцијације људских матичних ћелија in vivo коришћењем моноклонских антитела на GFAP, CALB и VIM открила је формирање и астроцита и неурона. За разлику од ћелија у трансплантацијама пацова, многе људске матичне ћелије су биле виментин-позитивне. Сходно томе, неке од људских мултипотентних ћелија нису прошле кроз диференцијацију. Исти аутори су касније показали да људске неуралне матичне ћелије трансплантиране без имуносупресије преживљавају у мозгу пацова 20 дана након трансплантације, без знакова имунолошке агресије од стране глијалних елемената зрелог мозга.

Утврђено је да се чак и неуралне матичне ћелије Drosophila калеме и диференцирају у мозгу таксона удаљеног од инсеката као што је пацов. Исправност ауторовог експеримента је несумњива: трансгене линије Drosophila садржале су гене за људске неуротрофичне факторе NGF, GDNF, BDNF, уметнуте у CaSper вектор испод промотора топлотног шока Drosophila, тако да је телесна температура сисара аутоматски изазвала њихову експресију. Аутори су идентификовали ћелије Drosophila по производу бактеријског гена галактозидазе користећи хистохемијско X-Gal бојење. Поред тога, испоставило се да неуралне матичне ћелије Drosophila специфично реагују на неуротрофичне факторе кодиране људским генима: приликом ксенотрансплантације ћелија трансгене линије Drosophila која садржи ген gdnf, синтеза тирозин хидроксилазе у њеним диференцирајућим неуронским матичним ћелијама се нагло повећала, а ћелије са геном ngf активно су производиле ацетилхолинестеразу. Ксенотрансплантат је изазвао сличне генски зависне реакције у алотрансплантату ембрионалног неуралног ткива трансплантираног заједно са њим.

Да ли то значи да је специфична диференцијација неуронских матичних ћелија индукована неуротрофичним факторима који нису специфични за врсту? Према резултатима аутора, неуротрофични фактори који производе ксенографт имали су специфичан ефекат на судбину алографта, који су се у овом случају развијали интензивније и били су 2-3 пута већи од алографта уведених у мозак без додатка ксенографта. Сходно томе, ћелије ксенографта које садрже гене за неуротрофине, посебно ген који кодира неуротрофични фактор изведен из људских глијалних ћелија (GDNF), имају ефекат на развој алографта који није специфичан за врсту, сличан дејству одговарајућег неуротрофина. Познато је да GDNF повећава преживљавање допаминергичких неурона у ембрионалном средњем мозгу пацова и побољшава метаболизам допамина од стране ових ћелија, и индукује диференцијацију ћелија позитивних на тирозин хидроксилазу, побољшавајући раст аксона и повећавајући величину тела неуронске ћелије. Слични ефекти су такође примећени у култивисаним допаминергичким неуронима средњег мозга пацова.

Активна миграција људских неуралних матичних ћелија примећена је након ксенотрансплантације у мозак зрелих пацова. Познато је да процес миграције и диференцијације неуралних матичних ћелија контролише скуп посебних гена. Иницијацијски сигнал миграције ћелији прекурсору за почетак диференцијације даје протеински производ c-ret протоонкогена заједно са GDNF-ом. Следећи сигнал долази од гена mash-1, који контролише избор пута развоја ћелија. Поред тога, специфична реакција ћелија које се диференцирају такође зависи од α-рецептора цилијарног неуротрофичног фактора. Дакле, с обзиром на потпуно различиту генетску конституцију ксеногених људских неуралних матичних ћелија и ћелија мозга пацова реципијента, неопходно је препознати не само неспецифичност неуротрофичних фактора у односу на врсту, већ и највиши еволутивни конзервативизам гена одговорних за специфичну диференцијацију елемената неуралних матичних ћелија.

Будућност ће показати да ли ће ксенотрансплантација ембрионалног неуроматеријала бити могућа у неурохируршкој пракси лечења неуродегенеративних патолошких процеса изазваних поремећајем синтезе мијелина од стране олигодендроцита. У међувремену, најинтензивније обрађивана питања неуротрансплантације су она која се односе на добијање алогених неуралних матичних ћелија из ембрионалног или зрелог мозга у култури са њиховом накнадном усмереном диференцијацијом у неуробласте или специјализоване неуроне.

Трансплантација неуралних матичних ћелија

Да би се стимулисала пролиферација и диференцијација неуралних матичних ћелија одраслог организма, може се трансплантирати ембрионално нервно ткиво. Могуће је да матичне ћелије ембрионалног нервног ткива унете алографтом саме могу проћи кроз пролиферацију и диференцијацију. Познато је да се након повреде кичме регенерација нервних проводника одвија кроз издуживање оштећених аксона и колатерално ницање аксона неоштећених наставка моторних неурона. Главни фактори који спречавају регенерацију кичмене мождине су формирање ожиљка везивног ткива у подручју оштећења, дистрофичне и дегенеративне промене у централним неуронима, недостатак NGF-а и присуство продуката разградње мијелина у подручју оштећења. Показано је да трансплантација различитих типова ћелија у оштећену кичмену мождину - фрагмената ишијадичког нерва одраслих животиња, ембрионалног окципиталног кортекса, хипокампуса, кичмене мождине, Шванових ћелија, астроцита, микроглије, макрофага, фибробласта - подстиче регенерацију оштећених аксона ницањем и омогућава новоформираним аксонима да расту кроз зону повреде кичмене мождине. Експериментално је доказано да трансплантација ембрионалног нервног ткива у подручје повреде кичмене мождине, деловањем неуротрофичних фактора, убрзава раст оштећених аксона, спречава стварање глијалног ожиљка и развој дистрофичних и дегенеративних процеса у централним неуронима, док ћелије трансплантираног ембрионалног нервног ткива преживљавају у кичменој мождини, интегришу се са суседним ткивима и подстичу раст аксона кроз подручје повреде уз формирање дендритичних синапси на спиналним неуронима.

Ова област регенеративно-пластичне медицине добила је највећи развој у Украјини захваљујући раду научног тима који је предводио В. И. Цимбаљук. Пре свега, то су експерименталне студије ефикасности трансплантације ембрионалног нервног ткива код повреда кичмене мождине. Током аутотрансплантације периферног нерва, аутори су посматрали најизраженије деструктивне промене у дисталној зони шава, где су 30. дана након операције комбиноване са репаративним процесима. Током алотрансплантације, морфофункционално стање имплантираног нерва 30. дана карактерисало се израженом деструкцијом са масном дегенерацијом и амилоидозом на позадини фокалне инфламаторне лимфоидне ћелијске инфилтрације са претежном атрофијом Шванових ћелија. Трансплантација ембрионалног нервног ткива допринела је обнављању проводљивости кичмене мождине у већој мери, посебно код животиња које су оперисане током првих 24 сата након повреде: на позадини смањења интензитета инфламаторних и деструктивних процеса, хипертрофије и хиперплазије ултраструктурних елемената спиналних неурона који синтетишу протеине и производе енергију, примећена је хипертрофија и хиперплазија олигодендроцита, амплитуда мишићног акционог потенцијала је обновљена за 50%, а брзина проводљивости импулса за 90%. Приликом процене ефикасности трансплантације ембрионалног нервног ткива у зависности од зоне трансплантације, утврђено је да су најбољи резултати примећени када је калем уведен директно у зону повреде кичмене мождине. Уз потпуну трансекцију кичмене мождине, трансплантација ембрионалног нервног ткива била је неефикасна. Динамичке студије су показале да је оптимално време за извођење трансплантације ембрионалног нервног ткива првих 24 сата након повреде кичмене мождине, док извођење операције током периода изражених секундарних исхемијско-инфламаторних промена које се јављају 2-9. дана након повреде треба сматрати неприкладним.

Познато је да тешка трауматска повреда мозга изазива снажну и продужену активацију липидне пероксидације у почетним и средњим фазама посттрауматског периода како у оштећеном можданом ткиву, тако и у телу у целини, а такође ремети процесе енергетског метаболизма у повређеном мозгу. Под овим условима, трансплантација ембрионалног нервног ткива у подручје трауматске повреде доприноси стабилизацији процеса липидне пероксидације и повећава потенцијал антиоксидативног система мозга и тела у целини, појачава његову антирадикалну заштиту 35-60. дана посттрауматског периода. У истом периоду након трансплантације ембрионалног нервног ткива, енергетски метаболизам и процеси оксидативне фосфорилације у мозгу се нормализују. Поред тога, показано је да се првог дана након експерименталне трауматске повреде мозга импеданса ткива повређене хемисфере смањује за 30-37%, контралатералне - за 20%, што указује на развој генерализованог церебралног едема. Код животиња које су подвргнуте трансплантацији ембрионалног нервног ткива, инволуција едема се одвијала знатно брже - већ седмог дана, просечна вредност импедансе ткива повређене хемисфере достигла је 97,8% контролног нивоа. Штавише, потпуна рестаурација вредности импедансе 30. дана забележена је само код животиња које су примиле трансплантацију ембрионалног нервног ткива.

Смрт неких неурона у мозгу након тешке краниоцеребралне повреде један је од главних узрока посттрауматских компликација. Неурони интегришућих допаминергичких и норадренергичких система средњег мозга и продужене мождине су посебно осетљиви на повреде. Смањење нивоа допамина у стриопалидалном комплексу и можданој кори значајно повећава ризик од развоја моторичких и менталних поремећаја, епилептиформних стања, а смањење производње допамина у хипоталамусу може бити узрок бројних вегетативних и соматских поремећаја који се примећују у касном посттрауматском периоду. Резултати студија спроведених код експерименталне краниоцеребралне повреде указују на то да трансплантација ембрионалног нервног ткива помаже у обнављању нивоа допамина у повређеној можданој хемисфери, допамина и норепинефрина у хипоталамусу, и повећању нивоа норепинефрина и допамина у средњем мозгу и продуженој мождини. Поред тога, као резултат трансплантације ембрионалног нервног ткива у повређену хемисферу мозга експерименталних животиња, процентуални однос фосфолипида се нормализује и повећава садржај масних киселина (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Ови подаци потврђују стимулацију регенеративно-пластичних процеса трансплантираним ембрионалним нервним ткивом и указују на репаративно-трофички ефекат трансплантата на мозак примаоца у целини.

Клиничко искуство особља Института за неурохирургију „А. П. Ромоданов“ Академије медицинских наука Украјине у трансплантацији ембрионалног нервног ткива код церебралне парализе, изузетно сложене патологије са тешком моторичком дисфункцијом, заслужује посебну пажњу. Клинички облици церебралне парализе зависе од нивоа оштећења интегралних структура одговорних за регулацију мишићног тонуса и формирање моторичких стереотипа. Тренутно постоји довољно доказа који подржавају чињеницу да патолошке промене у стриопалидално-таламокортикалном систему моторне контроле играју важну улогу у поремећајима моторичке функције и мишићног тонуса. Стриопалидална веза овог система врши контролну функцију путем нигростријаталне производње допамина. Директан пут за спровођење таламокортикалне контроле почиње од неурона путамена, посредован је гама-аминобутеричном киселином (ГАБА) и супстанцом П и пројектује се директно у моторну зону унутрашњег сегмента глобус палидуса и супстанције нигре. Индиректни пут, чији се ефекат остварује учешћем ГАБА и енкефалина, потиче од неурона путамена и утиче на језгра базалних ганглија кроз низ веза које укључују спољашњи сегмент глобус палидуса и субталамично једро. Поремећаји у проводљивости директног пута узрокују хипокинезију, док смањење проводљивости структура индиректног пута доводи до хиперкинезије са одговарајућим променама мишићног тонуса. Интегритет ГАБАергичких проводних путева на различитим нивоима у систему моторне контроле и интеграција допаминергичких веза на нивоу путамена су неопходни за регулацију таламокортикалних интеракција. Најчешћа манифестација моторне патологије код различитих облика церебралне парализе је кршење мишићног тонуса и уско повезана промена рефлексне мишићне активности.

Трансплантација ембрионалног нервног ткива код церебралне парализе захтева темељну анализу природе оштећења можданих структура. На основу одређивања нивоа допамина и ГАБА у субарахноидној цереброспиналној течности, аутори су детаљно описали ниво поремећаја интеграције функционалних можданих структура, што је омогућило објективизацију резултата хируршке интервенције и корекцију поновљених неуротрансплантација. Ембрионално нервно ткиво (материјал абортуса ембриона од 9 недеља) трансплантирано је у паренхим кортекса прецентралних вијуга можданих хемисфера у зависности од тежине атрофичних промена. У постоперативном периоду нису примећене компликације нити погоршање стања пацијената. Позитивна динамика је забележена код 63% пацијената са спастичним облицима, код 82% деце са атонично-естетским обликом, а само код 24% пацијената са мешовитим обликом болести. Утврђен је негативан ефекат високог нивоа неуросензитизације уз присуство аутоантитела на неуроспецифичне протеине на резултате операције. Трансплантација ембрионалног нервног ткива показала се неефикасном код пацијената узраста 8-10 година и више, као и у случајевима тешког хиперкинетичког синдрома и епилепсије. Клинички, ефикасност трансплантације ембрионалног нервног ткива код пацијената са спастичним облицима церебралне парализе манифестовала се формирањем нових статомоторних вештина и вољних покрета уз корекцију патолошког моторног стереотипа и смањење степена спастичности, патолошких положаја и ставова. Аутори сматрају да је позитиван ефекат трансплантације ембрионалног нервног ткива резултат нормализујућег ефекта на функционалну активност супраспиналних структура укључених у регулацију постуралног тонуса и вољних покрета. Истовремено, позитивне клиничке ефекте трансплантације ембрионалног нервног ткива прати смањење садржаја неуротрансмитера у субарахноидној цереброспиналној течности, што указује на обнављање интегралних интеракција погођених можданих структура.

Постоји још један тежак облик неуролошке патологије - апалични синдром, чији проблем лечења, нажалост, није ни близу решења. Апалични синдром је полиетиолошко субакутно или хронично стање које настаје као резултат тешких органских лезија централног нервног система (углавном мождане коре), а карактерише се развојем панапраксије и панагнозије са релативно очуваном функцијом сегментно-стабличних одељења и формација лимбично-ретикуларног комплекса мозга. Праћење студија (од 1 године до 3 године) показало је да апалични синдром није коначна дијагноза перзистентног оштећења нервног система код деце, већ се трансформише или у органску деменцију или у хронично вегетативно стање. У Одељењу за ресторативну неурохирургију Института за неурохирургију „А. П. Ромоданов“ Академије медицинских наука Украјине, 21 пацијент са последицама апалног синдрома је подвргнут трансплантацији ембрионалног нервног ткива. Под општом анестезијом, крунским бургијом је направљена рупа од бургије преко подручја најизраженијих атрофичних промена откривених компјутеризованом томографијом или магнетном резонанцом, а у присуству дифузне атрофије сиве или беле масе, трансплантат је уведен у прецентралне и централне гирусе мозга. Након отварања дуре матер, комадићи ткива из сензомоторног кортекса ембриона од 8-9 недеља су имплантирани интракортикално помоћу посебног уређаја. Број имплантираних узорака ткива кретао се од 4 до 10, што је одређено величином рупе од бургије и величином локалних промена у можданој материји. За разлику од других врста патологије, код апаличног синдрома аутори су настојали да имплантирају што више ембрионалног ткива у најприступачније делове мозга. Дура матер је ушивена, а извршена је пластична операција дефекта лобање. Током операције, код свих пацијената су уочене значајне промене како у кортексу (атрофија, одсуство вијуга, промена боје и пулсације мождане масе), тако и у можданим овојницама (задебљање дуре матер, значајно задебљање арахноидеалне мембране са присуством сопствених крвних судова, срастање мембрана са испод њих). Ове промене су биле израженије код пацијената са историјом инфламаторних лезија мозга. Код пацијената који су претрпели хипоксију ЦНС-а, преовладавале су дифузне атрофичне промене у можданој маси, посебно у кортексу, са повећањем субарахноидалног простора, без значајних промена у можданим овојницама. Половина пацијената је имала повећано крварење меких ткива, костију и мождане масе. Након операција, у року од шест месеци до три године, стање се побољшало код 16 пацијената, а код пет пацијената је остало непромењено. Позитивна динамика је примећена и у моторној и у менталној сфери. Мишићни тонус се смањио код десет пацијената, код 11 пацијената се повећала моторичка активност (смањење парезе,координација покрета побољшана), код петоро деце, манипулативна способност горњих удова значајно се повећала. Код четири пацијента смањена је учесталост и тежина епилептичних напада, а код једног детета уопште није било напада током целог периода посматрања након операције. Агресија се смањила код двоје деце, код два пацијента са тешким булбарним поремећајима побољшан је чин гутања, двоје деце је већ 2 недеље након операције могло самостално да жваће. Забележено је смањење тежине менталних поремећаја, деветоро деце се смирило након операције, сан и пажња су се побољшали код седам пацијената. Три пацијента са последицама апаличног синдрома почела су да препознају родитеље, један - да прате упутства, два - да изговарају речи, код троје се смањио степен дизартрије. Аутори напомињу да приметно побољшање стања пацијената почиње 2 месеца након операције, достиже максимум до 5-6 месеци, затим се темпо побољшања успорава и до краја године процес се стабилизује код 50% пацијената. Позитиван ефекат неуротрансплантације послужио је као основа за поновљену операцију код шест пацијената са последицама апаличног синдрома, али на другој хемисфери мозга. Техника и методе друге трансплантације биле су идентичне онима код прве операције, али је клинички ефекат друге операције био мањи, иако нису настале озбиљне компликације ни након прве ни након друге хируршке интервенције. Према ауторима, механизам терапијског ефекта неуротрансплантације повезан је са неуротрофичним ефектом трансплантираног ембрионалног нервног ткива, које садржи велики број супстанци раста, хормонских и других биолошки активних супстанци које стимулишу репарацију оштећених неурона и пластичну реорганизацију можданог ткива примаоца. Могућ је и активирајући ефекат на активност нервних ћелија које су раније биле морфолошки очуване, али су изгубиле своју функционалну активност због болести. Управо брзи неуротрофични ефекат може објаснити побољшање булбарних функција код неке деце већ на крају прве или друге недеље након операције. Претпоставља се да се, поред овога, до трећег или четвртог месеца успостављају морфофункционалне везе између трансплантата и мозга домаћина, кроз које неуротрансплантат замењује функције мртвих можданих ћелија, што је супстрат за побољшање и моторичких и менталних функција пацијената. Двоје деце је већ 2 недеље након операције било у стању да самостално жваће. Забележено је смањење тежине менталних поремећаја, деветоро деце се смирило након операције, сан и пажња су се побољшали код седам пацијената. Три пацијента са последицама апаличног синдрома почела су да препознају родитеље, један - да прате упутства, два - да изговарају речи.Код троје се степен дизартрије смањио. Аутори напомињу да приметно побољшање стања пацијената почиње 2 месеца након операције, достиже максимум за 5-6 месеци, затим се темпо побољшања успорава и до краја године процес се стабилизује код 50% пацијената. Позитиван ефекат неуротрансплантације послужио је као основа за поновљену операцију код шест пацијената са последицама апаличног синдрома, али на другој хемисфери мозга. Техника и метод друге трансплантације били су идентични онима код прве операције, али је клинички ефекат друге операције био мањи, иако није било озбиљних компликација ни након прве ни након друге хируршке интервенције. Према ауторима, механизам терапеутског ефекта неуротрансплантације повезан је са неуротрофичним ефектом трансплантираног ембрионалног нервног ткива, које садржи велики број супстанци раста, хормонских и других биолошки активних супстанци које стимулишу репарацију оштећених неурона и пластичну реорганизацију можданог ткива примаоца. Могућ је и активирајући ефекат на активност нервних ћелија које су раније биле морфолошки очуване, али су изгубиле своју функционалну активност због болести. Управо брзи неуротрофични ефекат може објаснити побољшање булбарних функција код неке деце већ на крају прве или друге недеље након операције. Претпоставља се да се, уз то, до трећег или четвртог месеца успостављају морфофункционалне везе између трансплантата и мозга домаћина, кроз које неуротрансплантат замењује функције мртвих можданих ћелија, што је супстрат за побољшање и моторичких и менталних функција пацијената. Двоје деце је већ 2 недеље након операције било у стању да самостално жваће. Забележено је смањење тежине менталних поремећаја, деветоро деце је постало мирније након операције, сан и пажња су се побољшали код седам пацијената. Три пацијента са последицама апалијског синдрома почела су да препознају родитеље, један - да прате упутства, два - да изговарају речи, код троје се смањио степен дизартрије. Аутори напомињу да приметно побољшање стања пацијената почиње 2 месеца након операције, достиже максимум до 5-6 месеци, затим се темпо побољшања успорава и до краја године процес се стабилизује код 50% пацијената. Позитиван ефекат неуротрансплантације послужио је као основа за поновљену операцију код шест пацијената са последицама апаличног синдрома, али на другој хемисфери мозга. Техника и метод друге трансплантације били су идентични онима код прве операције, али је клинички ефекат друге операције био мањи, иако није било озбиљних компликација ни након прве ни након друге хируршке интервенције. Према ауторима,Механизам терапеутског ефекта неуротрансплантације повезан је са неуротрофичним ефектом трансплантираног ембрионалног нервног ткива, које садржи велики број супстанци раста, хормонских и других биолошки активних супстанци које стимулишу репарацију оштећених неурона и пластичну реорганизацију можданог ткива примаоца. Могућ је и активирајући ефекат на активност нервних ћелија које су раније биле морфолошки очуване, али су изгубиле своју функционалну активност због болести. Управо брзи неуротрофични ефекат може објаснити побољшање булбарних функција код неке деце већ на крају прве или друге недеље након операције. Претпоставља се да се, уз то, до трећег или четвртог месеца успостављају морфофункционалне везе између трансплантата и мозга домаћина, кроз које неуротрансплантат замењује функције мртвих можданих ћелија, што је супстрат за побољшање и моторичких и менталних функција пацијената, иако нису настале озбиљне компликације ни након прве ни након друге хируршке интервенције. Према ауторима, механизам терапеутског ефекта неуротрансплантације повезан је са неуротрофичним ефектом трансплантираног ембрионалног нервног ткива, које садржи велики број супстанци раста, хормонских и других биолошки активних супстанци које стимулишу репарацију оштећених неурона и пластичну реорганизацију можданог ткива примаоца. Могућ је и активирајући ефекат на активност нервних ћелија које су раније биле морфолошки очуване, али су изгубиле своју функционалну активност због болести. Управо брзи неуротрофични ефекат може објаснити побољшање булбарних функција код неке деце већ на крају прве или друге недеље након операције. Претпоставља се да се, уз то, до трећег или четвртог месеца успостављају морфофункционалне везе између трансплантата и мозга домаћина, кроз које неуротрансплантат замењује функције мртвих можданих ћелија, што је супстрат за побољшање и моторичких и менталних функција пацијената, иако се нису јавиле озбиљне компликације ни након прве ни након друге хируршке интервенције. Према ауторима, механизам терапеутског ефекта неуротрансплантације повезан је са неуротрофичним ефектом трансплантираног ембрионалног нервног ткива, које садржи велики број супстанци раста, хормонских и других биолошки активних супстанци које стимулишу репарацију оштећених неурона и пластичну реорганизацију можданог ткива примаоца. Могућ је и активирајући ефекат на активност нервних ћелија које су претходно биле морфолошки очуване, али су изгубиле своју функционалну активност услед болести.Управо брзи неуротрофични ефекат може објаснити побољшање булбарних функција код неке деце већ крајем прве или друге недеље након операције. Претпоставља се да се, уз ово, до трећег или четвртог месеца успостављају морфофункционалне везе између трансплантата и мозга домаћина, путем којих неуротрансплантат замењује функције мртвих можданих ћелија, што је супстрат за побољшање и моторичких и менталних функција пацијената.

Експериментално је проучаван ефекат трансплантације ембрионалног нервног ткива на реорганизацију интернеуронских међусобних веза. Аутори су проучавали обрасце обнављања интермодуларних аксонских веза у подручју механичког оштећења мождане коре код белих пацова са и без трансплантације ембрионалног нервног ткива користећи флуоресцентну липофилну ознаку DIL (1,1-диоктадецил-3,3,33'-тетраметилиндокарбоцијанин перхлорат) и конфокално ласерско скенирање. Утврђено је да уношење ембрионалног нервног ткива у подручје оштећења обезбеђује раст аксона, који се након проласка кроз трансплантат повезују са суседним можданим ткивом, док без трансплантације ембрионалног нервног ткива подручје оштећења представља непремостиву препреку за раст аксона. У овом раду је извршена трансплантација ембрионалног (15-17. дан гестације) неокортекса. Резултати које су аутори добили су додатни докази у прилог активног утицаја трансплантације ембрионалног нервног ткива на посттрауматску реорганизацију интернеуронских односа суседних структурних и функционалних модула мождане коре. Трансплантација ембрионалног нервног ткива обезбеђује делимично обнављање веза између оштећених подручја мождане коре стварањем повољних услова за раст аксона у зони деловања неуротрофичних фактора трансплантата. Постојање таквог ефекта је експериментално доказано и у литератури се разматра као доказ високих пластичних могућности оштећеног мозга полно зрелих животиња. У том смислу, трансплантација ћелија се тренутно сматра оптималном терапијском стратегијом за обнављање функције оштећеног људског ЦНС-а.

Подаци које су аутори добили о ефикасности коришћења ембрионалног нервног ткива мозга као егзогеног трансплантационог медијума за раст аксона потврђују перспективе циљаног стварања комуникационих веза између интактних суседних области мозга. Рад на проучавању ефекта трансплантације нервног ткива на динамику функционалних параметара централног нервног система делује релевантно. Задатак рада био је да се истражи ефекат трансплантације ембрионалног локус коерулеуса (ЛК) на морфофункционалне индексе ЛК неурона и локомоторну активност прималаца. Примаоци су били женски Вистар пацови, а донори ембриони пацова исте линије стари 18 дана. Трансплантација ембрионалног ЛК је извршена у шупљину треће коморе мозга. Хистолошки, прихватање калема је откривено код 75% животиња прималаца. У случајевима прихватања, калем је био уз зид коморе, испуњавајући 1/5-2/5 њеног лумена и био је одржив. Након 1 и 6 месеци након операције, трансплантирано нервно ткиво, према својим морфолошким карактеристикама, представљало је структуре које би настале током њиховог нормалног онтогенетског развоја, тј. структуре кичмене мождине (ЛМ). Подаци које су аутори добили указују на то да се код животиња којима је трансплантиран ембрионални ланж ЛМ, динамичка активност мења, а матрична активност хроматина једара ћелија ЛМ повећава. Сходно томе, активност неурона сопствене ЛМ се интензивира, али је и калемљени трансплантат функционално активан. Познато је да се такозвани локомоторни регион средњег мозга практично поклапа са локализацијом ЛМ. Аутори сматрају да је основа за промену моторичке активности пацова реципијената активација ћелија ЛМ, како сопствених, тако и трансплантата, са ослобађањем велике количине норепинефрина, укључујући и у сегментима кичмене мождине. Стога се претпоставља да је повећање моторичке активности у условима трансплантације ЛМ у интактни мозак животиња последица присуства функционално активног трансплантата интегрисаног са мозгом реципијента и који доприноси активацији локомоторне активности код пацова.

Поред тога, показано је да трансплантиране неуроепителне ћелије ембрионалних рудимента неокортекса и кичмене мождине преживљавају и диференцирају се у неуробласте, младе и зреле неуроне у року од 1-2 месеца након њихове трансплантације у оштећени ишијадични нерв зрелих пацова. Приликом проучавања динамике развоја NADPH-позитивних неурона ембрионалних рудимента неокортекса и кичмене мождине пацова у хетеротопским алографтима (15-дневни ембрион пацова), на уздужним пресецима кроз ишијадичне живце пацова реципијената откривено је прихватање 70 до 80% неурографтова, што је зависило од периода посматрања. Уни- и биполарни неуробласти са заобљеним светлим једрима и једним или два нуклеола почели су да се формирају у графтовима недељу дана након операције, што је праћено формирањем кластера. Аутори нису успели да детектују ћелије које садрже NADPH диафоразу (NADPH-d) међу неуробластима. После 7 дана, само ћелијски елементи крвних судова били су NADPH-позитивни - капиларне ендотелне ћелије у дебљини трансплантата, као и ендотелне и глаткомишићне ћелије крвних судова ишијадичког нерва примаоца. Пошто се у ћелијама глатких мишића крвних судова индукција NO синтазе (NOS) одвија под утицајем IL-1, аутори повезују појаву NADPH-позитивних глаткомишићних ћелија у крвним судовима ишијадичког нерва са присуством IL-1 синтетисаног у оштећеним нервним стаблима. Познато је да се неурогенеза у условима трансплантације ембрионалних рудимента мозга одвија синхроно са развојем неурона in situ. Резултати морфолошких студија указују на то да диференцијација неких неуронских елемената трансплантата седам дана након трансплантације одговара диференцијацији ћелија у сличним деловима мозга новорођених пацова. Дакле, у условима хетеротопске трансплантације у периферни нерв, трансплантиране ембрионалне нервне ћелије показују способност синтезе NADPH-d. У овом случају, више неурона који садрже NADPH-d налази се у трансплантатима кичмене мождине него у трансплантатима неокортекса, али синтеза азот-оксида почиње у трансплантираним неуронима касније него током развоја in situ. У ЦНС-у кичмењака, NOS-позитивне ћелије се појављују већ у пренаталном периоду. Верује се да NO подстиче формирање синаптичких веза у мозгу у развоју, а присуство NOS-позитивних нервних аферентних влакана која обезбеђују синтезу NO у церебеларним неуробластима стимулише миграцију и диференцијацију неурона, због чега се формира нормална цитоархитектура мозга. У тектуму је утврђена важна улога NO у синапсогенези - само они неурони који су имали синаптичке везе са ћелијама мрежњаче показали су се као NOS-позитивни.

Познато је да је азот-оксид један од регулатора мождане активности, где се формира из аргинина под утицајем NO синтазе, која има дијафоразну активност. У централном нервном систему, NO се синтетише у ендотелним ћелијама крвних судова, микроглији, астроцитима и неуронима различитих делова мозга. Након трауматске повреде мозга, као и током хипоксије и исхемије, примећује се повећање броја неурона који садрже NO, што је један од регулатора церебралног протока крви. С обзиром на способност NO да индукује синапсогенезу, проучавање формирања ћелија које садрже NO у условима неуротрансплантације на позадини трауматског оштећења нервног ткива примаоца је од посебног интереса.

Ништа мање важно није проучавање утицаја неуротрансплантације на условни рефлексни стереотип понашања. У експериментима на проучавању утицаја интрацеребралне и дистантне (између CII и CIII) трансплантације ткива ембрионалног локус цоерулеуса (17-19 дана гестације) на процесе памћења и садржај катехоламина код пацова са уништењем фронтотемпоралног неокортекса, показано је да електролитичко оштећење фронтотемпоралног кортекса мозга ремети стереотип условне рефлексне емоционалне реакције избегавања (памћења), слаби физиолошку активност, смањује садржај норепинефрина у зони коагулисаног неокортекса, али повећава његов ниво у хипоталамусу, где се примећује смањење концентрације адреналина, иако се његова количина у крви и надбубрежним жлездама повећава.

Као резултат интрацеребралне трансплантације ткива ембрионалног локус коерулеуса, стереотип условљеног рефлекса емоционалне реакције избегавања, поремећен електролитичким оштећењем фронтотемпоралних региона мождане коре, обнавља се код 81,4% животиња, садржај адреналина у ретикуларној формацији средњег мозга, хипоталамусу и неокортексу се нормализује, а његов ниво у хипокампусу се чак повећава, што је комбиновано са смањењем концентрације адреналина у крви.

Даљинска трансплантација ткива ембрионалног локус коерулеуса не само да обнавља поремећени стереотип условљеног рефлекса емоционалне реакције избегавања код пацова са електролитичким оштећењем фронтотемпоралног кортекса, већ и повећава садржај норепинефрина и адреналина, углавном у хипоталамусу, крви, надбубрежним жлездама и срцу. Претпоставља се да је то последица васкуларизације трансплантата, продора неуротрансмитера у крвоток, њиховог проласка кроз крвно-мождану баријеру и активације механизама поновног преузимања адреналина и норепинефрина типовима преузимања 1, 2, 3. Аутори сматрају да се дугорочна стабилизација нивоа норепинефрина у условима прихватања и функционисања трансплантата може сматрати феноменом његовог прогресивног ослобађања у минималним дозама од стране неурона локус коерулеуса.

Позитивни клинички ефекти трансплантације ембрионалног нервног ткива могу бити последица и способности овог другог да утиче на процесе васкуларне неоплазме, у чијој регулацији директно учествују фактори раста и цитокини. Васкулогенезу активирају ангиогени фактори раста - васкуларни ендотелни фактор раста (VEGF), FGF, PDGF и TGF, који се синтетишу током исхемије, што делује као почетни момент ангиогенезе. Доказано је да се исцрпљивање васкуларног потенцијала раста јавља током процеса старења организма, што игра значајну улогу у патогенези болести као што су коронарна болест срца и облитерирајућа атеросклероза доњих екстремитета. Исхемија ткива се развија и код многих других болести. Уношење ангиогених фактора у исхемијске зоне (терапеутска ангиогенеза) стимулише раст крвних судова у исхемијским ткивима и побољшава микроциркулацију због развоја колатералне циркулације, што, заузврат, повећава функционалну активност погођеног органа.

VEGF и FGF се сматрају најперспективнијим за клиничку употребу. Резултати првих рандомизованих студија били су охрабрујући, посебно ако су оптималне дозе и начини примене ангиогених фактора правилно одабрани. У том смислу, спроведена је експериментална процена ангиогене активности екстракта изолованог из ткива људског ембрионалног мозга. У раду је коришћен абортирани материјал добијен у двадесетој недељи трудноће и обрађен према методи И. Мачиога и др. (1979) како је модификовано од стране IC ANRF. Овај лек је аналог „Додатка за раст ендотелних ћелија“ („Sigma“) и представља природну мешавину људских ангиогених фактора, која укључује VEGF и FGF. Експерименти су спроведени на пацовима са моделима исхемије ткива задњих екстремитета и миокарда. На основу проучавања активности алкалне фосфатазе код експерименталних животиња којима је дат екстракт ткива ембрионалног нерва, утврђено је повећање броја капилара по јединици површине миокарда - како у уздужним, тако и у попречним пресецима срца. Ангиогена активност препарата манифестовала се директном применом у исхемијску зону, као и у случају системске (интрамускуларне) примене, што је довело до смањења просечне површине постинфарктног ожиљка.

У било којој варијанти трансплантације ембрионалног нервног ткива, изузетно је важно правилно одабрати гестацијску старост трансплантираног ембрионалног материјала. Упоредна анализа ефикасности ћелијских препарата из ембрионалног вентралног мезенцефалона ембриона пацова старих 8, 14 и 16-17 дана три месеца након интрастријаталне неуротрансплантације зрелим пацовима са паркинсонизмом у аутоматизованом тесту моторне асиметрије индуковане апоморфином открила је значајно већу ефикасност препарата ћелија ЦНС-а из ембриона старих 8 дана и најнижу ефикасност из ембрионалног нервног ткива старих 16-17 дана. Добијени подаци су корелирали са резултатима хистоморфолошке анализе, посебно са величином трансплантата, тежином глијалне реакције и бројем допаминергичких неурона у њима.

Разлике у терапеутском ефекту ћелија ембрионалног нервног ткива могу бити повезане и са степеном незрелости и посвећености самих ћелија и са њиховим различитим одговорима на факторе раста ослобођене у подручју индукованог оштећења допаминергичких неурона. Конкретно, ефекат EGF и FGF2 на развој теленцефалних неуралних матичних ћелија in vivo јавља се у различитим фазама ембриогенезе. Неуроепителне ћелије мишјих ембриона старих 8,5 дана, када се култивишу in vitro у медијуму без серума, пролиферишу у присуству FGF2, али не и EGF, на који реагују само популације матичних ћелија изоловане из мозга ембриона у каснијим фазама развоја. Истовремено, неуралне матичне ћелије пролиферишу као одговор на сваки од ових митогена и адитивно појачавају раст у случају додавања EGF и FGF2 у културу са ниском густином сејања ћелија. ЕГФ-реактивне неуралне матичне ћелије из герминативних зона мишјих ембриона старих 14,5 дана сматрају се линеарним потомцима ФГФ-реактивних неуралних матичних ћелија које се први пут појављују након 8,5 дана гестације. Потенцијални фенотип неуралних матичних и прогениторских ћелија зависи од комплексног ефекта њиховог микроокружења. Имунофенотипизација неуралних ћелија из перивентрикуларних и хипокампалних зона људских ембриона старих 8-12 и 17-20 недеља проточном цитофлуорометријом открила је значајну варијабилност повезану и са гестацијском старошћу и са индивидуалним конституционалним карактеристикама донорског биоматеријала. Када се ове неуралне прогениторске ћелије култивишу у селективној подлози без серума са ЕГФ, ФГФ2 и НГФ, неуросфере се формирају брзином која значајно зависи од гестацијске старости. Ћелије из различитих делова мозга људских ембриона старих 5-13 недеља, када се кратко култивишу са FGF2 у монослојној култури на ламинин супстрату у присуству трагова фактора раста, одржавају пролиферацију током 6 недеља са високим процентом нестин-позитивних ћелија на позадини спонтаног формирања ћелија са маркерима све три линије неуралне диференцијације. Ћелије изоловане из мезенцефалона људског ембриона у периоду гестације дужем од 13 недеља, пролиферирају под утицајем EGF-а и такође формирају неуросфере. Синергистички ефекат је постигнут коришћењем комбинације EGF-а и FGF2. Најинтензивнија пролиферација неуронских матичних ћелија са формирањем неуросфера примећена је приликом култивације ткива мождане коре људских ембриона старих 6-8 недеља у присуству EGF2, IGF1 и 5% коњског серума на супстрату са фибронектином.

Треба напоменути да питања која се тичу гестацијске старости и пресека ембрионалног ЦНС-а, чије је ткиво пожељније користити у сврху неуротрансплантације, остају отворена. Одговоре на њих треба тражити у неурогенези мозга у развоју, која се наставља током целог пренаталног периода - у време када епител неуралне цеви формира вишеслојну структуру. Верује се да је извор матичних ћелија и нових неурона радијална глија, која се састоји од издужених ћелија са дугим наставцима радијално усмереним у односу на зид можданих везикула и додирује унутрашњу површину комора и спољашњу пиалну површину можданог зида. Раније је радијална глија била обдарена само функцијом неуронског тракта дуж којег неуробласти мигрирају из вентралног региона у површинске делове, а такође јој је додељена и скелетна улога у процесу формирања исправне ламинарне организације кортекса. Данас је утврђено да се, како развој напредује, радијална глија трансдиференцира у астроците. Значајан део код сисара се смањује одмах након рођења, међутим, код оних животињских врста код којих је радијална глија очувана до одраслог доба, неурогенеза се активно одвија у постнаталном периоду.

У култури, радијалне глијалне ћелије из ембрионалног неокортекса глодара формирале су неуроне и глијалне ћелије, при чему су неурони претежно формирани у гестацијској доби ембрионалног развоја од 14 до 16 дана (период максималног интензитета неурогенезе у можданој кори мишева и пацова). 18. дана ембриогенезе, диференцијација се померила ка формирању астроцита са значајним смањењем броја новоформираних неурона. Ин ситу обележавање радијалних глијалних ћелија помоћу GFP-а омогућило је детекцију асиметричне деобе обележених ћелија у шупљини церебралних везикула ембриона пацова старих 15 до 16 дана са појавом ћелија-кћерки са имунолошким и електрофизиолошким карактеристикама неуробласта. Важно је напоменути да, према резултатима динамичких посматрања, настали неуробласти користе матичну ћелију радијалних глијалних ћелија за миграцију на површину пијале.

Ендогени маркер радијалне глије је интермедијерни филаментни протеин нестин. Коришћењем методе флуоресцентног протока сортирања ћелија обележених ретровирусом повезаним са GFP-ом и експримираним под контролом нестина, показано је да матичне ћелије дентатног гируса и хилуса људског хипокампуса (материјал је добијен током операција за епилепсију) експримирају нестин. Стога, оне припадају радијалној глији, која је код људи, као и код других сисара, очувана само у дентатном гирусу.

Истовремено, ефикасност трансплантације ћелија одређена је не само високом виталношћу донорских ћелија, њиховим потенцијалом диференцијације и способношћу да замене дефектне ћелије, већ, пре свега, њиховом усмереном миграцијом. Потпуна функционална интеграција трансплантираних ћелија зависи од њихове способности миграције - без нарушавања цитоархитектуре мозга примаоца. Пошто радијална глија подлеже скоро потпуној редукцији у постнаталном периоду, било је неопходно открити како се донорске ћелије могу кретати из зоне трансплантације до места оштећења мозга код одраслих прималаца. Постоје две варијанте миграције ћелија у ЦНС које не зависе од радијалне глије: феномен тангенцијалне миграције или кретања неуробласта током развоја мождане коре нормално на мрежу радијалне глије, као и миграција „у низу“ или „дуж ланца“. Конкретно, миграција неуронских прогениторских ћелија из ростралне субвентрикуларне зоне у олфакторни сијалицу одвија се као низ чврсто суседних ћелија окружених глијалним ћелијама. Верује се да ове ћелије користе партнерске ћелије као супстрат за миграцију, а главни регулатор таквих међућелијских интеракција је PSA-NCAM (полисијализовани молекул адхезије неуронских ћелија). Стога, неуронска миграција не захтева нужно учешће радијалне глије или већ постојећих аксонских веза. Екстрарадијални облик кретања ћелија у „низ“ дуж ростралног миграционог тракта одржава се током целог живота, што указује на реалну могућност циљане испоруке трансплантираних неуралних ћелија прогенитора у зрели нервни систем.

Постоји хипотеза о присуству линије матичних ћелија у онтогенези мозга, према којој је у раним фазама развоја мозга матична ћелија неуроепителна ћелија, која се, како сазрева, трансдиференцира у радијалну глију. У одраслом добу, улогу матичних ћелија обављају ћелије које имају карактеристике астроцита. Упркос низу контроверзних тачака (противречности у вези са матичним ћелијама хипокампуса, као и дубоким деловима мозга који немају слојевити кортекс и развијају се из таламичких туберкула, где је радијална глија одсутна), јасан и једноставан концепт доследне промене фенотипа матичних ћелија током онтогенезе изгледа веома привлачно.

Утицај фактора микроокружења на одређивање и накнадну диференцијацију неуронских диференцијатних ћелија јасно је демонстриран трансплантацијом зрелих матичних ћелија кичмене мождине пацова у различите регионе зрелог нервног система. Када су матичне ћелије трансплантиране у дентатни гирус или у регион неуронске миграције у олфакторним булбусима, примећена је активна миграција трансплантираних ћелија, са формирањем бројних неурона. Трансплантација матичних ћелија у кичмену мождину и регион Амоновог рога резултирала је формирањем астроцита и олигодендроцита, док је трансплантација у дентатни гирус резултирала формирањем не само глијалних ћелија, већ и неурона.

Код зрелог пацова, број ћелија које се деле у дентатном гирусу може достићи неколико хиљада дневно - мање од 1% од укупног броја грануларних ћелија. Неурони чине 50-90% ћелија, астоцити и други глијални елементи - око 15%. Преостале ћелије немају антигене особине неурона и глије, али садрже антигене ендотелних ћелија, што указује на блиску везу између неурогенезе и ангиогенезе у дентатном гирусу. Присталице могућности диференцијације ендотелних ћелија у неуронске прекурсорске ћелије позивају се на способност ендотелних ћелија in vitro да синтетишу BDNF.

Брзина самосклапања неуронских кола је импресивна: током диференцијације, прекурсорске ћелије грануларних ћелија мигрирају у дентатни гирус и формирају процесе који расту ка САЗ зони Амоновог рога и формирају синапсе са пирамидалним глутаматергичким и интеркаларним инхибиторним неуронима. Новостворене грануларне ћелије се интегришу у постојећа неуронска кола у року од 2 недеље, а прве синапсе се појављују већ 4-6 дана након настанка нових ћелија. Честом применом BrdU или 3H-тимидина (једна од метода за идентификацију одраслих матичних ћелија) зрелим животињама, у Амоновом рогу је пронађен велики број обележених неурона и астроцита, што указује на могућност формирања нових неурона не само у дентатном гирусу, већ и у другим деловима хипокампуса. Интересовање за процесе деобе, диференцијације и ћелијске смрти у дентатном гирусу хипокампуса зрелог мозга је такође последица чињенице да су неурони који се овде формирају локализовани у једној од кључних области хипокампуса, одговорној за процесе учења и памћења.

Дакле, данас је утврђено да неуралне прогениторске ћелије потичу из ћелија субепендималне зоне латералне коморе зрелих глодара. Оне мигрирају дуж ростралног миграционог тракта који формирају лонгитудинално оријентисане астроглијалне ћелије до олфакторне булбусе, где се уграђују у слој грануларних ћелија и диференцирају у неуроне ове структуре. Миграција прогениторских неуралних ћелија је откривена у ростралном миграционом тракту одраслих мајмуна, што указује на могућност формирања нових неурона у олфакторној булбуси примата. Неуралне матичне ћелије су изоловане из олфакторне булбусе одраслог човека и пребачене у линије, чије се клониране ћелије диференцирају у неуроне, астроците и олигодендроците. Матичне ћелије су пронађене у хипокампусу зрелог мозга пацова, мишева, мајмуна и људи. Неуралне матичне ћелије субгранулиране зоне дентатне фасције су извор прогениторских ћелија које мигрирају до медијалних и латералних екстремитета хипокампуса, где се диференцирају у зреле грануларне ћелије и глијалне елементе. Аксони де ново формираних неурона дентатне фасције прате се до CA3 поља, што указује на учешће новоформираних неурона у спровођењу функција хипокампуса. У асоцијационим областима неокортекса одраслих мајмуна пронађене су неуронске прогениторске ћелије које мигрирају из субвентрикуларне зоне. У слоју VI неокортекса мозга миша, нови пирамидални неурони се детектују 2-28 недеља након индукованог оштећења и смрти матичних неурона овог слоја услед миграције претходно успаваних прогениторских ћелија субвентрикуларне зоне. Коначно, стварност постнаталне неурогенезе у људском мозгу доказује се двоструким повећањем броја кортикалних неурона, које се наставља током првих 6 година након рођења.

Од не малог значаја за практичну трансплантацију ћелија је питање регулације процеса репродукције и диференцијације неуралних матичних и прогениторских ћелија. Најважнији фактори који сузбијају пролиферацију неуралних прогениторских ћелија су глукокортикоиди, који нагло смањују број подела, док уклањање надбубрежних жлезда, напротив, значајно повећава број митоза (Gould, 1996). Важно је напоменути да је морфогенеза дентатног гируса код глодара најинтензивнија током прве две недеље постнаталног развоја у периоду одсуства реакције на стрес на позадини наглог смањења производње и секреције стероидних хормона коре надбубрежне жлезде. Кортикостероиди инхибирају миграцију грануларних ћелија - нови неурони се не уграђују у грануларни слој дентатног гируса, већ остају у хилусу. Претпоставља се да су истовремено поремећени и процеси формирања синаптичких веза. Заштита ћелија од такве „стероидне агресије“ спроводи се минималном експресијом минералокортикоидних и глукокортикоидних рецептора на пролиферирајућим грануларним ћелијама не само током развоја дентатног гируса, већ и код зрелих животиња. Међутим, од свих неурона мозга, управо неурони хипокампуса карактеришу се највећим садржајем глукокортикоидних рецептора, што узрокује стресни ефекат на хипокампус. Психоемоционални стрес и стресне ситуације инхибирају неурогенезу, а хронични стрес нагло смањује способност животиња да стичу нове вештине и уче. Израженији негативан ефекат хроничног стреса на неурогенезу је сасвим разумљив ако узмемо у обзир претежно мирно стање неуронских матичних ћелија. Приликом имобилизације гравидних пацова (за глодаре - изузетно јак фактор стреса), утврђено је да пренатални стрес такође изазива смањење броја ћелија у дентатном гирусу и значајно инхибира неурогенезу. Познато је да глукокортикоиди учествују у патогенези депресивних стања, чији је морфолошки еквивалент инхибиција неурогенезе, патолошка реорганизација неурона и интернеуронских веза и смрт нервних ћелија. С друге стране, антидепресивни хемотерапијски агенси активирају формирање неурона de novo, што потврђује везу између процеса формирања нових неурона у хипокампусу и развоја депресије. Естрогени имају значајан утицај на неурогенезу, чији су ефекти супротни дејству глукокортикостероида и састоје се у подржавању пролиферације и виталности неуронских ћелија прогенитора. Треба напоменути да естрогени значајно повећавају способност учења код животиња. Неки аутори повезују цикличне промене у броју грануларних ћелија и њихов вишак код женки са утицајем естрогена.

Познато је да неурогенезу контролишу EGF, FGF и BDNF, међутим, механизми дејства спољашњих сигнала на матичне ћелије из митогена и фактора раста нису довољно проучени. Утврђено је да PDGF in vitro одржава неуронски правац диференцијације ћелија прогенитора, а цилијарни неуротрофични фактор (CNTF), попут тријодотиронина, стимулише формирање претежно глијалних елемената - астроцита и олигодендроцита. Протеин који активира аденилат циклазу хипофизе (PACAP) и вазоактивни интестинални пептид (VIP) активирају пролиферацију неуронских ћелија прогенитора, али истовремено инхибирају процесе диференцијације ћелија ћерке. Опиоиди, посебно у случају њиховог дуготрајног излагања, значајно инхибирају неурогенезу. Међутим, опиоидни рецептори нису идентификовани у матичним ћелијама и ћелијама прогенитора зубастог гируса (присутни су у диференцирајућим неуронима ембрионалног периода), што нам не дозвољава да проценимо директне ефекте опиоида.

Потребе практичне регенеративно-пластичне медицине приморале су истраживаче да посебну пажњу посвете проучавању плури- и мултипотентности матичних ћелија. Примена ових својстава на нивоу регионалних матичних ћелија одраслог организма могла би у будућности осигурати производњу неопходног материјала за трансплантацију. Горе је показано да епигенетска стимулација неуралних матичних ћелија омогућава добијање пролиферирајућих ћелија које су већ преформиране према неуралним фенотиповима, што ограничава њихов број. У случају коришћења тотипотентних својстава ембрионалне матичне ћелије, пролиферација док се не добије довољан број ћелија дешава се раније него неурална диференцијација, а умножене ћелије се лако претварају у неурални фенотип. Да би се добиле неуралне матичне ћелије, ембрионалне матичне ћелије (ЕСЦ) се изолују из унутрашње ћелијске масе бластоцисте и култивишу у обавезном присуству LIF-а, што чува њихову тотипотентност и способност неограничене деобе. Након тога, неурална диференцијација ЕСЦ се индукује употребом ретиноинске киселине. Трансплантација добијених неуралних матичних ћелија у стријатум оштећен хинолином и 6-хидроксидопамином прати се њиховом диференцијацијом у допаминергичке и серотонергичке неуроне. Након ињекције у коморе ембрионалног мозга пацова, неуронске прогениторске ћелије изведене из ембрионалних ћелија (ЕСЦ) мигрирају у различите регионе мозга примаоца, укључујући кортекс, стријатум, септум, таламус, хипоталамус и мали мозак. Ћелије које остају у вентрикуларној шупљини формирају епителне структуре које подсећају на неуронску цев, као и појединачна острвца не-неуралног ткива. У паренхиму мозга ембриона примаоца, трансплантиране ћелије производе три главна типа ћелија нервног система. Неке од њих имају издужене апикалне дендрите, пирамидална ћелијска тела и базалне аксоне који се пројектују у corpus callosum. Астроцити донорског порекла продужавају наставке до оближњих капилара, а олигодендроцити блиско контактирају мијелинске муфове, учествујући у формирању мијелина. Дакле, неуронске прогениторске ћелије добијене из ЕСЦ in vitro способне су за усмерену миграцију и регионалну диференцијацију адекватну сигналима микроокружења, обезбеђујући многе области мозга у развоју неуронима и глијом.

Неки аутори разматрају могућност де- и трансдиференцијације регионалних матичних ћелија одраслог организма. Индиректну потврду дедиференцијације ћелија у култури са ширењем њихових потенцијала пружају подаци о калемљењу мишјих неуронских матичних ћелија у црвеној коштаној сржи са накнадним развојем ћелијских линија из њих, што даје функционално активне ћелије периферне крви. Поред тога, трансплантација генетски обележених (LacZ) ћелија неуросфере добијених из зрелог или ембрионалног мозга у мозак озрачених мишева са супресираном хематопоезом довела је до формирања не само неуралних деривата из матичних ћелија, већ је изазвала и стварање крвних ћелија, што указује на плурипотентност неуралних матичних ћелија, реализовану ван мозга. Дакле, неурална матична ћелија је способна да се диференцира у крвне ћелије под утицајем сигнала из микроокружења коштане сржи са претходном трансформацијом у хематопоетску матичну ћелију. С друге стране, приликом трансплантације хематопоетских матичних ћелија коштане сржи у мозак, утврђена је њихова диференцијација под утицајем микроокружења можданог ткива у глијалне и неуралне ћелије. Сходно томе, потенцијал диференцијације неуралних и хематопоетских матичних ћелија није ограничен специфичношћу ткива. Другим речима, фактори локалног микроокружења, различити од оних карактеристичних за ткива мозга и коштане сржи, способни су да промене смер диференцијације ових ћелија. Показано је да неуралне матичне ћелије унете у венски систем озрачених мишева стварају популације мијелоидних, лимфоидних и незрелих хематопоетских ћелија у слезини и коштаној сржи. Ин витро је утврђен ефекат морфогенетских протеина коштане сржи (БМП) на преживљавање и диференцијацију неуралних матичних ћелија, одређујући, као и у раним фазама ембриогенезе, њихов развој у неуралном или глијалном правцу. У културама неуралних матичних ћелија из 16-дневних ембриона пацова, БМП индукују формирање неурона и астроглије, док се у културама матичних ћелија изведених из перинаталног мозга формирају само астроцити. Поред тога, БМП сузбијају стварање олигодендроцита, који се ин витро појављују само уз додатак антагониста БМП-а, ногина.

Процеси трансдиференцијације нису специфични за врсту: хематопоетске матичне ћелије људске коштане сржи трансплантиране у стријатум зрелих пацова мигрирају у белу масу спољашње капсуле, ипси- и контралатералног неокортекса, где формирају ћелијске елементе сличне астроцитима (Azizi et al., 1998). Када се матичне ћелије коштане сржи алотрансплантирају у латералну комору новорођених мишева, миграција хематопоетских матичних ћелија може се пратити до структура предњег мозга и малог мозга. У стријатуму и молекуларном слоју хипокампуса, мигрирале ћелије се трансформишу у астроците, а у олфакторној булбици, унутрашњем слоју грануларних ћелија малог мозга и ретикуларној формацији можданог стабла, формирају ћелије сличне неуронима са позитивном реакцијом на неурофиламенте. Након интравенске примене хематопоетских ћелија одраслим мишевима, микро- и астроцити обележени GFP-ом су детектовани у неокортексу, таламусу, можданом стаблу и малом мозгу.

Поред тога, мезенхималне матичне ћелије коштане сржи, које дају порекло свим врстама ћелија везивног ткива, такође могу проћи кроз неуралну трансдиференцијацију под одређеним условима (подсетимо се да су ембрионални извор мезенхима ћелије неуралног гребена). Показано је да стромалне ћелије коштане сржи људи и мишева, култивисане in vitro у присуству EGF или BDNF, експресују маркер неуралних ћелија прогенитора нестин, а додавање различитих комбинација фактора раста доводи до формирања ћелија са маркерима глије (GFAP) и неурона (нуклеарни протеин, NeuN). Обележене сингене мезенхималне матичне ћелије трансплантиране у латералну комору мозга новорођених мишева мигрирају и локализују се у предњем мозгу и малом мозгу без нарушавања цитоархитектуре мозга примаоца. Мезенхималне матичне ћелије коштане сржи диференцирају се у зреле астроците у стријатуму и молекуларном слоју хипокампуса и насељавају олфакторну сијалицу, грануларне слојеве малог мозга и ретикуларну формацију, где се трансформишу у неуроне. Матичне ћелије мезенхималне коштане сржи човека способне су да се диференцирају у макроглију in vitro и интегришу у структуре мозга пацова након трансплантације. Директна трансплантација мезенхималних матичних ћелија коштане сржи у хипокампус одраслих пацова такође је праћена њиховом миграцијом у паренхим мозга и неуроглијалном диференцијацијом.

Претпоставља се да трансплантација матичних ћелија коштане сржи може проширити могућности ћелијске терапије болести ЦНС-а које карактерише прекомерна патолошка смрт неурона. Треба, међутим, напоменути да сви истраживачи не препознају чињеницу међусобне трансформације неуралних и хематопоетских матичних ћелија, посебно in vivo, што је опет због недостатка поузданог маркера за процену њихове трансдиференцијације и даљег развоја.

Трансплантација матичних ћелија отвара нове хоризонте за ћелијску генску терапију наследне неуролошке патологије. Генетска модификација неуралних матичних ћелија подразумева уметање генетских регулаторних конструкција, чији производи интерагују са протеинима ћелијског циклуса у режиму аутоматске регулације. Трансдукција таквих гена у ембрионалне прогениторске ћелије користи се за умножавање неуралних матичних ћелија. Већина генетски модификованих ћелијских клонова понаша се као стабилне ћелијске линије, не показујући знаке трансформације in vivo или in vitro, али имају изражену способност за контактну инхибицију пролиферације. Када се трансплантирају, умножене трансфектоване ћелије се интегришу у ткиво реципијента без нарушавања цитоархитектуре и без подвргавања туморској трансформацији. Донорске неуралне матичне ћелије не деформишу зону интеграције и равноправно се такмиче за простор са прогениторским ћелијама домаћина. Међутим, другог-трећег дана, интензитет деобе трансфектантних ћелија нагло се смањује, што одговара контактној инхибицији њихове пролиферације in vitro. Ембриони-примаоци трансфектантних неуралних матичних ћелија немају абнормалности у развоју централног нервног система, сви делови мозга који су у контакту са трансплантатом се нормално развијају. Након трансплантације, клонови неуралних матичних ћелија брзо мигрирају из зоне ињекције и често прелазе одговарајуће ембрионалне зоне дуж ростралног тракта, адекватно се интегришући са другим областима мозга. Интеграција генетски модификованих клонова и трансфектованих ћелијских линија неуралних матичних ћелија у мозак организма домаћина карактеристична је не само за ембрионални период: ове ћелије се имплантирају у бројне области централног нервног система фетуса, новорођенчета, одраслог, па чак и старијег организма примаоца и показују способност адекватне интеграције и диференцијације. Конкретно, након трансплантације у вентрикуларну шупљину мозга, трансфектоване ћелије мигрирају без оштећења крвно-мождане баријере и постају интегралне функционалне ћелијске компоненте можданог ткива. Донорски неурони формирају одговарајуће синапсе и експресују специфичне јонске канале. Уз очуван интегритет крвно-мождане баријере, астроглија, дериват трансфектованих неуралних матичних ћелија, проширује процесе на церебралне судове, а олигодендроцити изведени из донора експресују мијелински базни протеин и мијелинизирају неуронске процесе.

Поред тога, неуралне матичне ћелије се трансфектују за употребу као ћелијски вектори. Такви векторско-генетски конструкти обезбеђују in vivo стабилну експресију страних гена укључених у развој нервног система, или се користе за исправљање постојећих генетских дефеката, будући да су производи ових гена способни да компензују различите биохемијске абнормалности централног нервног система. Висока миграциона активност трансфектованих матичних ћелија и адекватна имплантација у герминативне зоне различитих области мозга у развоју омогућавају нам да се надамо потпуној рестаурацији наследног недостатка ћелијских ензима. Приликом моделирања синдрома атаксије-телангиектазије (мутантне линије мишева pg и pcd), Пуркињеове ћелије нестају из малог мозга експерименталних животиња током првих недеља постнаталног развоја. Показано је да је уношење неуралних матичних ћелија у мозак таквих животиња праћено њиховом диференцијацијом у Пуркињеове ћелије и грануларне неуроне. Код pcd мутаната, поремећаји координације покрета су делимично кориговани, а интензитет тремора је смањен. Слични резултати су добијени трансплантацијом клонираних људских неуралних матичних ћелија у примате код којих је дегенерација Пуркињеових ћелија индукована употребом онконазе. Након трансплантације, неуралне матичне ћелије донора пронађене су у грануларним, молекуларним и Пуркињеовим ћелијским слојевима паренхима малог мозга. Стога, генетска модификација неуралних ћелија прогенитора може обезбедити стабилну посвећену модификацију фенотипа која је отпорна на спољашње утицаје. Ово је посебно важно код патолошких процеса повезаних са развојем фактора код примаоца који спречавају преживљавање и диференцијацију ћелија донора (нпр. током имунолошке агресије).

Мукополисахаридоза типа VII код људи карактерише се неуродегенерацијом и прогресивним интелектуалним инвалидитетом, што је код мишева моделирано мутацијом делеције у гену бета-глукуронидазе. Након трансплантације трансфектованих неуралних матичних ћелија које луче бета-глукуронидазу у церебралне коморе новорођених дефектних мишева реципијената, донорске ћелије се прво налазе у терминалној зони, а затим се шире по целом можданом паренхиму, стабилно исправљајући интегритет лизозома у мозгу мутантних мишева. У моделу Теј-Саксове болести, неуралне матичне ћелије трансдуковане ретровирусом, када се ин утеро примене на мишје фетусе и трансплантирају у новорођене мишеве, обезбеђују ефикасну експресију бета-подјединице бета-хексозаминидазе код реципијената са мутацијом која доводи до патолошке акумулације бета2-ганглиозида.

Још један правац регенеративне медицине је стимулација пролиферативног и диференцијационог потенцијала сопствених неуралних матичних ћелија пацијента. Конкретно, неуралне матичне ћелије луче NT-3 током хемисекције кичмене мождине и асфиксије мозга код пацова, експресују NGF и BDNF у септуму и базалним ганглијама, тирозин хидроксилазе у стријатуму, као и реелин у малом мозгу и мијелински базни протеин у мозгу.

Међутим, питањима стимулације неурогенезе очигледно се не поклања довољно пажње. Неколико студија сугерише да се функционално оптерећење нервних центара одговорних за разликовање мириса огледа у формирању нових неурона. Код трансгених мишева са дефицитом молекула неуронске адхезије, смањење интензитета неурогенезе и смањење броја неурона који мигрирају ка олфакторним булусима комбиновано је са оштећењем способности разликовања мириса, иако праг перцепције мириса и краткорочна олфакторна меморија нису били нарушени. Функционално стање ћелија дентатног гируса игра важну улогу у регулацији неурогенезе: слабљење ефекта глутамата на грануларне ћелије након уништења енториналног кортекса подстиче пролиферацију и диференцијацију неурона, а стимулација влакана перфорантног пута (главног аферентног улаза у хипокампус) изазива инхибицију неурогенезе. Антагонисти НМДА рецептора активирају процесе формирања нових неурона, док агонисти, напротив, смањују интензитет неурогенезе, што по својој суштини подсећа на дејство глукокортикостероида. У литератури се налазе контрадикторни резултати истраживања: информације о експериментално доказаном инхибиторном ефекту ексцитаторног неуротрансмитера глутамата на неурогенезу нису у складу са подацима о стимулацији пролиферације ћелија прогенитора и појави нових неурона са повећањем нападне активности у хипокампусу животиња са експерименталним каиновиим и пилокарпинским моделима епилепсије. Истовремено, у традиционалном моделу епилепсије изазване вишеструком субпраговном стимулацијом одређеног подручја мозга (киндлинг) и карактерисане мање израженом смрћу неурона, интензитет неурогенезе се повећава тек у касној фази киндлинга, када се у хипокампусу примећује оштећење и смрт неурона. Показано је да код епилепсије нападна активност стимулише неурогенезу са абнормалном локализацијом нових грануларних неурона, од којих се многи појављују не само у дентатном гирусу већ и у хилусу. Такви неурони су од великог значаја у развоју клијања маховитих влакана, јер њихови аксони формирају нормално одсутне обрнуте колатерале који формирају бројне синапсе са суседним грануларним ћелијама.

Употреба регионалних неуронских матичних ћелија отвара нове перспективе за примену ћелијске трансплантације у лечењу метаболичких и генетских неуродегенеративних болести, демијелинизирајућих болести и посттрауматских поремећаја централног нервног система. Пре извођења трансплантације ћелија замене према једној од метода, врши се селекција и проширење потребног типа неуронских ћелија прогенитора ex vivo са циљем њиховог накнадног уношења директно у оштећено подручје мозга. Терапеутски ефекат у овом случају је последица замене оштећених ћелија или локалног ослобађања фактора раста и цитокина. Ова метода регенеративно-пластичне терапије захтева трансплантацију довољно великог броја ћелија са унапред одређеним функционалним карактеристикама.

Даља истраживања молекуларних карактеристика и регенеративно-пластичног потенцијала зрелих можданих матичних ћелија, као и способности регионалних матичних ћелија различитог ткивног порекла да се трансдиференцирају, такође треба сматрати одговарајућим. Данас је већ спроведен скрининг антигена хематопоетских матичних ћелија коштане сржи, са одређивањем маркер комбинације ћелија способних за трансдиференцијацију у неуралне матичне прогениторске ћелије (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Добијене су ћелије које формирају неуросфере in vitro и формирају неуроне када се трансплантирају у мозак новорођених имунодефицијентних мишева. Од интереса за ћелијску ксенотрансплантологију су резултати студија о могућности унакрсне трансплантације матичних ћелија код јединки еволутивно удаљених таксона. Резултати имплантације неуралних матичних ћелија у подручје тумора мозга остају без одговарајуће интерпретације: трансплантиране ћелије активно мигрирају кроз запремину тумора не прелазећи његове границе, а када се ћелије унесу у нетакнути део мозга, примећује се њихова активна миграција ка тумору. Питање биолошког значаја такве миграције остаје отворено.

Треба напоменути да је успешна трансплантација неуралних матичних ћелија, као и других неуралних ћелија прогенитора добијених из ембрионалних ћелија (ЕМЦ), могућа само када се користе високо пречишћене неуралне ћелије прогенитора, јер се недиференциране ембрионалне матичне ћелије неизбежно трансформишу у тератоме и тератокарциноме када се трансплантирају одраслом имунокомпетентном примаоцу. Чак и минимална количина слабо диференцираних ћелија у суспензији донорских ћелија нагло повећава туморигеност трансплантата и неприхватљиво повећава ризик од развоја тумора или формирања не-неуралног ткива. Добијање хомогених популација неуралних ћелија прогенитора је могуће када се користе ћелије које настају у одређеним фазама нормалне ембриогенезе као алтернативни извор донорског ткива. Други приступ укључује пажљиво елиминисање нежељених ћелијских популација селекцијом специфичном за лозу. Употреба ЕМЦ за неуротрансплантацију након њиховог недовољног излагања факторима раста in vitro је такође опасна. У овом случају, не може се искључити неуспех програма неуралне диференцијације са формирањем структура својствених неуралној цеви.

Данас је сасвим очигледно да неуралне матичне ћелије показују тропизам за патолошки измењене области централног нервног система и имају изражен регенеративно-пластични ефекат. Микроокружење на месту смрти ћелија нервног ткива моделира правац диференцијације трансплантираних ћелија, чиме надокнађује недостатак специфичних неуронских елемената унутар зоне оштећења ЦНС-а. У неким неуродегенеративним процесима, настају неурогени сигнали за рекапитулацију неурогенезе, а неуралне матичне ћелије зрелог мозга су у стању да одговоре на ове поучне информације. Бројни експериментални подаци служе као јасна илустрација терапеутског потенцијала неуронских матичних ћелија. Интрацистернална примена клона неуронских матичних ћелија животињама са лигацијом средње мождане артерије (модел исхемијског можданог удара) помаже у смањењу површине и запремине деструктивно измењеног подручја мозга, посебно у случају трансплантације неуронских матичних ћелија заједно са FGF2. Имуноцитохемијски се примећује миграција донорских ћелија у исхемијску зону са њиховом накнадном интеграцијом са интактним ћелијама мозга реципијента. Трансплантација незрелих ћелија мишје неуроепителни линије MHP36 у мозак пацова са експерименталним можданим ударом побољшава сензомоторну функцију, а уношење ових ћелија у мождане коморе појачава когнитивну функцију. Трансплантација неурално преформираних хематопоетских ћелија људске коштане сржи пацовима елиминише дисфункцију мождане коре узроковану исхемијским оштећењем. У овом случају, ксеногене неуронске прогениторске ћелије мигрирају са места ињекције у зону деструктивних промена у можданом ткиву. Интракранијална трансплантација хомологних ћелија коштане сржи код трауматског оштећења мождане коре код пацова доводи до делимичне рестаурације моторичке функције. Донорске ћелије се учвршћују, пролиферишу, подлежу неуронској диференцијацији у неуроне и астроците и мигрирају ка лезији. Када се убризгају у стријатум одраслих пацова са експерименталним можданим ударом, клониране људске неуронске матичне ћелије замењују оштећене ћелије ЦНС-а и делимично обнављају оштећену функцију мозга.

Људске неуралне матичне ћелије се углавном изолују из ембрионалног теленцефалона, који се развија много касније од каудално смештених делова нервног стабла. Показана је могућност изоловања неуралних матичних ћелија из кичмене мождине људског фетуса старог 43-137 дана, јер у присуству EGF и FGF2 ове ћелије формирају неуросфере и показују мултипотентност у раним пасажима, диференцирајући се у неуроне и астроците. Међутим, дуготрајна култивација неуралних прогениторских ћелија (преко 1 године) лишава их мултипотентности - такве ћелије су способне да се диференцирају само у астроците, тј. постају унипотентне. Регионалне неуралне матичне ћелије могу се добити као резултат парцијалне булбектомије и, након размножавања у култури у присуству LIF, трансплантирати истом пацијенту са неуродегенеративним променама у другим деловима централног нервног система. У клиници је први пут спроведена терапија заменом ћелија употребом неуралних матичних ћелија за лечење пацијената са можданим ударом праћеним оштећењем базалних ганглија мозга. Као резултат трансплантације донорских ћелија, примећено је побољшање клиничког стања већине пацијената.

Неки аутори сматрају да способност неуронских матичних ћелија да се прилагоде, мигрирају и интегришу у различите области нервног ткива у случају оштећења ЦНС-а отвара неограничене могућности за ћелијску терапију не само локалних, већ и екстензивних (мождани удар или асфиксија), мултифокалних (мултипла склероза) па чак и глобалних (већина наследних метаболичких поремећаја или неуродегенеративних деменција) патолошких процеса. Заиста, када се клониране мишје и људске неуралне матичне ћелије трансплантирају у животиње примаоце (мишеве и примате, респективно) са дегенерацијом допаминергичких неурона у мезостријаталном систему изазваном уношењем метил-фенил-тетрапиридина (модел Паркинсонове болести) 8 месеци пре трансплантације, донорске неуралне матичне ћелије се интегришу у ЦНС примаоца. Месец дана касније, трансплантиране ћелије су локализоване билатерално дуж средњег мозга. Неки од резултирајућих неурона донорског порекла експресују тирозин хидролазу у одсуству знакова имунолошке реакције на трансплантацију. Код пацова којима је примењен 6-хидроксидопамин (још један експериментални модел Паркинсонове болести), адаптација трансплантираних ћелија на микроокружење у мозгу домаћина била је одређена условима култивације неуралних матичних ћелија пре њихове трансплантације. Неуралне матичне ћелије, које се брзо размножавају in vitro под утицајем EGF-а, ефикасније су надокнадили недостатак допаминергичких неурона у оштећеном стријатуму него ћелије из култура старих 28 дана. Аутори сматрају да је то због губитка способности перцепције одговарајућих сигнала диференцијације током процеса ћелијске деобе неуралних ћелија-прогенитора in vitro.

У неким студијама покушано је повећање ефикасности утицаја на процесе реинервације оштећеног стријатума трансплантацијом ембрионалних ћелија стријатума у ову област као извора неуротрофичних фактора уз истовремено пресађивање допаминергичких неурона вентралног мезенцефалона. Како се испоставило, ефикасност неуротрансплантације у великој мери зависи од начина уношења ембрионалног нервног ткива. Као резултат студија о трансплантацији препарата ембрионалног нервног ткива у вентрикуларни систем мозга (како би се избегла повреда паренхима стријатума), добијене су информације о њиховом позитивном дејству на моторички дефект код паркинсонизма.

Међутим, у другим студијама, експериментална посматрања су показала да трансплантација препарата ембрионалног нервног ткива вентралног мезенцефалона који садрже допаминергичке неуроне у церебралну комору, као и трансплантација ГАБА-ергичких ембрионалних неуронских елемената у стријатум пацова са хемипаркинсонизмом, не доприноси обнављању оштећених функција допаминергичког система. Напротив, имуноцитохемијска анализа је потврдила податке о ниској стопи преживљавања допаминергичких неурона вентралног мезенцефалона трансплантираних у стријатум пацова. Терапеутски ефекат интравентрикуларне трансплантације ембрионалног нервног ткива вентралног мезенцефалона остварен је само под условом истовремене имплантације препарата ембрионалних стријаталних ћелија у денервисани стријатум. Аутори сматрају да је механизам овог ефекта повезан са позитивним трофичким ефектом ГАБА-ергичких елемената ембрионалног стријатума на специфичну допаминергичку активност интравентрикуларних трансплантата вентралног мезенцефалона. Изражена глијална реакција у трансплантатима праћена је благом регресијом параметара теста са апоморфином. Ово последње је, заузврат, корелирало са садржајем GFAP-а у крвном серуму, што је директно указивало на кршење пропустљивости крвно-мождане баријере. На основу ових података, аутори су закључили да се ниво GFAP-а у крвном серуму може користити као адекватан критеријум за процену функционалног стања трансплантата, а повећана пропустљивост крвно-мождане баријере за неуроспецифичне антигене као што је GFAP представља патогенетску карику у развоју неуспеха трансплантата услед аутоимуног оштећења нервног ткива примаоца.

Са становишта других истраживача, калемљење и интеграција неуралних матичних ћелија након трансплантације су стабилни и доживотни, будући да се донорске ћелије налазе код прималаца најмање две године након трансплантације и без значајног смањења њиховог броја. Покушаји да се ово објасни чињеницом да у недиференцираном стању неуралне матичне ћелије не експресују молекуле MHC класе I и II на нивоу довољном да изазову имунолошку реакцију одбацивања могу се сматрати истинитим само у односу на ниско диференциране неуралне прекурсоре. Међутим, нису све неуралне матичне ћелије у мозгу примаоца очуване у незрелом стању мировања. Већина њих пролази кроз диференцијацију, током које се молекули MHC експресују у потпуности.

Посебно, недовољна ефикасност коришћења интрастријаталне трансплантације препарата ембрионалног вентралног мезенцефалона који садрже допаминергичке неуроне за лечење експерименталног паркинсонизма повезана је са ниском стопом преживљавања трансплантираних допаминергичких неурона (само 5-20%), што је узроковано реактивном глиозом која прати локалну трауму можданог паренхима током трансплантације. Познато је да локална траума можданог паренхима и истовремена глиоза доводе до нарушавања интегритета крвно-мождане баријере са ослобађањем антигена нервног ткива, посебно ОЦАР-а и неурон-специфичног антигена, у периферну крв. Присуство ових антигена у крви може изазвати производњу специфичних цитотоксичних антитела на њих и развој аутоимуне агресије.

В. Цимбаљук и коаутори (2001) извештавају да и даље важи традиционално гледиште, према којем је централни нервни систем имунолошки привилегована зона изолована од имуног система крвно-можданом баријером. У свом прегледу литературе, аутори наводе низ радова који указују да ово гледиште не одговара у потпуности суштини имуних процеса у мозгу сисара. Утврђено је да обележене супстанце унете у паренхим мозга могу достићи дубоке цервикалне лимфне чворове, а након интрацеребралне ињекције антигена, у телу се формирају специфична антитела. Ћелије цервикалних лимфних чворова реагују на такве антигене пролиферацијом, почев од 5. дана након ињекције. Формирање специфичних антитела је такође откривено током трансплантације коже у паренхим мозга. Аутори прегледа наводе неколико хипотетичких путева за транспорт антигена из мозга у лимфни систем. Један од њих је прелазак антигена из периваскуларних простора у субарахноидални простор. Претпоставља се да су периваскуларни простори локализовани дуж великих крвних судова мозга еквивалент лимфног система у мозгу. Други пут лежи дуж белих влакана - кроз етмоидну кост у лимфне судове носне слузокоже. Поред тога, постоји опсежна мрежа лимфних судова у дура матер. Непропусност крвно-мождане баријере за лимфоците је такође прилично релативна. Доказано је да су активирани лимфоцити способни да производе ензиме који утичу на пропустљивост структура можданог „имуног филтера“. На нивоу посткапиларних венула, активирани Т-хелпери продиру кроз нетакнуту крвно-мождану баријеру. Теза о одсуству ћелија у мозгу које представљају антигене не издржава критику. Тренутно је убедљиво доказана могућност представљања антигена у ЦНС-у од стране најмање три врсте ћелија. Прво, то су дендритичне ћелије изведене из коштане сржи које су локализоване у мозгу дуж великих крвних судова и у белој маси. Друго, антигени су способни да презентују ендотелне ћелије крвних судова мозга, а у спрези са МХЦ антигенима, што подржава клонски раст Т ћелија специфичних за ове антигене. Треће, микро- и астроглијалне ћелије делују као агенси који презентују антигене. Учествујући у формирању имуног одговора у централном нервном систему, астроцити стичу својства имуне ефекторске ћелије и експресују бројне антигене, цитокине и имуномодулаторе. Када се инкубирају са γ-интерфероном (γ-INF), астроглијалне ћелије in vitro експресују МХЦ антигене класе I и II, а стимулисани астроцити су способни за презентацију антигена и одржавање клонске пролиферације лимфоцита.

Траума можданог ткива, постоперативна упала, едем и фибринске наслаге које прате трансплантацију ембрионалног нервног ткива стварају услове за повећану пропустљивост крвно-мождане баријере са поремећеном аутотолеранцијом, сензибилизацијом и активацијом CD3+CD4+ лимфоцита. Презентацију ауто- и алоантигена врше астроцити и микроглијалне ћелије које реагују на y-INF експресијом MHC молекула, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, костимулаторних молекула B7-1 (CD80) и B7-2 (CD86), као и секрецијом IL-la, IL-ip и y-INF.

Сходно томе, чињеница дужег преживљавања ембрионалног нервног ткива након интрацеребралне трансплантације него након његове периферне примене тешко се може повезати са одсуством покретања трансплантационог имунитета. Штавише, моноцити, активирани лимфоцити (цитотоксичне CD3+CD8+ и Т-помоћне ћелије) и цитокини које они производе, као и антитела на антигене периферног трансплантата ембрионалног нервног ткива, играју главну улогу у процесу његовог одбацивања. Низак ниво експресије MHC молекула у ембрионалном нервном ткиву је од одређеног значаја у стварању услова за дужу отпорност неуротрансплантата на Т-ћелијске имунолошке процесе. Због тога се у експерименту имунолошка упала након трансплантације ембрионалног нервног ткива у мозак развија спорије него након калемљења коже. Ипак, потпуно уништење појединачних трансплантата нервног ткива је примећено након 6 месеци. У овом случају, Т-лимфоцити ограничени MHC антигенима класе II су претежно локализовани у зони трансплантације (Nicholas et al., 1988). Експериментално је утврђено да током ксенолошке неуротрансплантације, смањење Т-помоћних ћелија (L3T4+), али не и цитотоксичних Т-лимфоцита (Lyt-2), продужава преживљавање нервног ткива пацова у мозгу мишева примаоца. Одбацивање неуротрансплантата прати његова инфилтрација макрофагима домаћина и Т-лимфоцитима. Сходно томе, макрофаги домаћина и активиране микроглијалне ћелије делују in situ као имуностимулишуће ћелије које презентују антиген, а повећана експресија донорских МХЦ антигена класе I појачава убилачку активност цитотоксичних Т-лимфоцита примаоца.

Нема смисла анализирати бројне спекулативне покушаје да се чињеница одбацивања неуротрансплантата објасни реакцијом имуног система примаоца на ендотелне ћелије или глијалне елементе донора, будући да су чак и чисте линије неуралних ћелија прогенитора подложне имунолошком нападу. Вреди напоменути да експресија Fas лиганда од стране можданих ћелија које везују рецепторе за апоптозу (Fas молекуле) на Т лимфоцитима који инфилтрирају мозак и индукују њихову апоптозу игра важну улогу у механизмима дужег преживљавања трансплантата унутар ЦНС-а, што је типичан заштитни механизам трансбаријерних аутоимуногених ткива.

Како В. Цимбаљук и коаутори (2001) с правом примећују, трансплантација ембрионалног нервног ткива карактерише се развојем упале уз учешће ћелија сензибилизованих на мождане антигене и активираних ћелија, антитела, а такође и као резултат локалне производње цитокина. Важну улогу у томе игра претходно постојећа сензибилизација организма на мождане антигене, која се јавља током развоја болести ЦНС-а и може бити усмерена на антигене трансплантата. Због тога се заиста дугорочно преживљавање хистоинкомпатибилних неуротрансплантата постиже само сузбијањем имуног система циклоспорином А или уношењем моноклонских антитела у CD4+ лимфоците примаоца.

Стога, многи проблеми неуротрансплантације остају нерешени, укључујући и оне који се односе на имунолошку компатибилност ткива, што се може решити тек након циљаних фундаменталних и клиничких истраживања.