Мезенхималне матичне ћелије

Међу регионалним матичним ћелијама, посебно место заузимају мезенхималне матичне ћелије (МСЦ), чији деривати чине стромални матрикс свих органа и ткива људског тела. Приоритет у истраживању МСЦ припада представницима руске биолошке науке.

Средином прошлог века, у лабораторији А. Фриденштајна, први пут је изолована хомогена култура мултипотентних стромалних матичних ћелија коштане сржи. Мезенхималне матичне ћелије причвршћене за подлогу дуго су одржавале висок интензитет пролиферације, а у културама са ниском густином сетве након фиксације на подлози формирале су клонове ћелија сличних фибробластима које нису имале фагоцитну активност. Престанак пролиферације МСК завршио се њиховом спонтаном диференцијацијом in vitro у ћелије коштаног, масног, хрскавичног, мишићног или везивног ткива. Даља истраживања омогућила су утврђивање остеогеног потенцијала ћелија сличних фибробластима строме коштане сржи различитих врста сисара, као и њихове активности формирања колонија. Експерименти in vivo показали су да и хетеро- и ортотопска трансплантација ћелија сличних фибробластима које формирају колоније резултира формирањем коштаног, хрскавичног, фиброзног и масног ткива. Пошто се стромалне матичне ћелије коштане сржи карактеришу високим капацитетом за самообнављање и вишеструком диференцијацијом унутар једне ћелијске линије, називају се мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије.

Треба напоменути да су током 45 година фундаменталних истраживања мезенхималних матичних ћелија створени реални услови за употребу њихових деривата у клиничкој пракси.

Данас нема сумње да се сва ткива људског тела формирају из матичних ћелија различитих ћелијских линија као резултат процеса пролиферације, миграције, диференцијације и сазревања. Међутим, донедавно се веровало да су матичне ћелије у одраслом организму ткивно-специфичне, тј. способне да производе линије специјализованих ћелија само оних ткива у којима се налазе. Овај концептуални став је оповргнут чињеницама трансформације хематопоетских матичних ћелија не само у ћелијске елементе периферне крви, већ и у овалне ћелије јетре. Поред тога, испоставило се да су неуралне матичне ћелије способне да дају и неуроне и глијалне елементе, као и рано посвећене линије хематопоетских ћелија прогенитора. Заузврат, мезенхималне матичне ћелије, које обично производе ћелијске елементе костију, хрскавице и масног ткива, способне су да се трансформишу у неуралне матичне ћелије. Претпоставља се да се у процесу раста, физиолошке и репаративне регенерације ткива, неопредељене ћелије прогенитора генеришу из ткивно-неспецифичних матичних резерви. На пример, репарација мишићног ткива може се остварити захваљујући мезенхималним матичним ћелијама које мигрирају из коштане сржи у скелетне мишиће.

Иако такву унакрсну заменљивост матичних ћелија не препознају сви истраживачи, могућност клиничке употребе мезенхималних матичних ћелија као извора за трансплантацију ћелија и ћелијског вектора генетских информација више нико не оспорава, као ни мултипотентност стромалних матичних ћелија коштане сржи, које се релативно лако могу изоловати и проширити у in vitro култури. Истовремено, извештаји о потенцијалној плурипотентности стромалних матичних ћелија коштане сржи и даље се појављују у научној литератури. Као доказ, наводе се истраживачки протоколи у којима се, под утицајем специфичних индуктора трансдиференцијације, МСК трансформишу у нервне ћелије, кардиомиоците и хепатоците. Међутим, неки научници имају озбиљне сумње у могућност поновљене активације и експресије гена из периода ране ембриогенезе. Истовремено, свима је јасно да ако се пронађу услови за проширење мултипотентности мезенхималних матичних ћелија на плурипотентност ЕМЦ, многи етички, морални, верски и правни проблеми у регенеративној пластичној медицини биће аутоматски решени. Поред тога, пошто у овом случају извор регенеративног матичног потенцијала постају аутологне стромалне ћелије пацијента, проблем имуног одбацивања ћелијског трансплантата је такође решен. Блиска будућност ће показати колико су ови изгледи реални.

[ 1 ], [ 2 ]

Употреба мезенхималних матичних ћелија у медицини

У клиници, употреба деривата мезенхималних матичних ћелија првенствено је повезана са рестаурацијом ткивних дефеката који настају код опсежних и дубоких термичких лезија коже. У преклиничкој фази спроведена је експериментална процена изводљивости коришћења алогених мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима за лечење дубоких опекотина. Показано је да мезенхималне матичне ћелије сличне фибробластима коштане сржи формирају монослој у култури, што омогућава њихову трансплантацију ради оптимизације процеса регенерације дубоких опекотина. Аутори напомињу да ембрионални фибробласти имају слично својство, али је њихова клиничка употреба ограничена постојећим етичким и правним проблемима. Дубока термичка опекотина са оштећењем свих слојева коже моделирана је на Вистар пацовима. Површина опекотине је била 18-20% укупне површине коже. Прва експериментална група обухватала је пацове са дубоком термичком опекотином и трансплантацијом алогених мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима. Другу групу чиниле су животиње са дубоком термичком опекотином и трансплантацијом алогених ембрионалних фибробласта. Трећу групу су представљали контролни пацови са дубоком термичком опекотином који нису подвргнути ћелијској терапији. Суспензија мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима и ембрионалних фибробласта нанета је на површину опекотине помоћу пипете у количини од 2 x ^10⁴ћелије другог дана након моделирања опекотина и ексцизије настале некротичне красте. Након трансплантације ћелија, површина опекотина је прекривена газом навлаженом изотоничним раствором натријум хлорида са гентамицином. Ћелије коштане сржи су сакупљене да би се добиле МСК са њиховом накнадном индукцијом у линију фибробластима сличних мезенхималних матичних ћелија од одраслих Вистар пацова из фемура. Ембрионални фибробласти су добијени из плућа ембриона старих 14-17 дана. Ембрионални фибробласти и ћелије коштане сржи за добијање МСК су претходно култивисани у Петријевим шољама на температури од 37°C у CO2 инкубатору, у атмосфери са 5% CO2 при влажности од 95%. Ембрионални фибробласти су култивисани 4-6 дана, док је за формирање монослоја МСК било потребно од 14 до 17 дана. Након тога, МСК су криопрезервиране као изворни материјал за фибробластоподобне мезенхималне матичне ћелије, које су добијене одмрзавањем и култивацијом МСК током 4 дана. Број формираних фибробластоподобних мезенхималних матичних ћелија био је више од 3 пута већи од броја ембрионалних фибробласта формираних током истог периода култивације. Да би се идентификовале трансплантиране ћелије у ранама од опекотина у фази култивације, њихов геном је обележен коришћењем вирусног шатл вектора заснованог на рекомбинантном аденовирусу типа V који носи 1ac-2 ген који кодира E. coli ß-галактозидазу. Живе ћелије у различито време након трансплантације су имунохистохемијски детектоване у криопресецима са додатком X-Gal супстрата, који даје карактеристичну плаво-зелену боју. Као резултат динамичке визуелне, планиметријске и хистолошке процене стања ране од опекотина, утврђено је да се већ 3. дана након трансплантације ћелија појављују значајне разлике у току процеса ране у одабраним групама. Ова разлика је постала посебно изражена 7. дана након трансплантације ћелија. Код животиња прве групе, којима су трансплантиране мезенхималне матичне ћелије сличне фибробластима, рана је добила једнолично интензивну ружичасту боју, гранулационо ткиво је порасло по целој површини до нивоа епидермиса, а површина опекотине се значајно смањила. Колагенски филм формиран на површини ране постао је нешто тањи, али је наставио да покрива целу површину опекотине. Код животиња друге групе, којима су трансплантирани ембрионални фибробласти, гранулационо ткиво се подигло до нивоа епидермиса ивица ране, али само местимично, док је плазмореја из ране била интензивнија него у првој групи, а почетно формирани колагенски филм је практично нестао. Код животиња које нису примале ћелијску терапију, седмог дана рана од опекотине је била бледа, са јамицама, некротично ткиво прекривено фибрином. Плазмореја је примећена по целој површини опекотине. Хистолошки, животиње прве и друге групе показале су смањење ћелијске инфилтрације и развој васкуларне мреже,и ови знаци започетог регенеративног процеса били су израженији код пацова 1. групе. У контролној групи примећени су знаци ћелијске инфилтрације ране, хистолошки образац новоформираних крвних судова је био одсутан. Од 15. до 30. дана посматрања, површина опекотине код животиња 1. групе била је значајно мања него код пацова осталих група, а гранулирајућа површина је била развијенија. Код животиња 2. групе, површина опекотине се такође смањила у поређењу са величином опекотинских рана код пацова контролне групе, што је настало услед маргиналне епителизације. У контролној групи, површина опекотине је остала бледа на местима са ретким гранулацијама, на њој су се појавиле васкуларне звездице, постојала су острвца фибринозног плака, умерена плазмореја се наставила по целој површини опекотине, а на неким местима је остала краста коју је било тешко одвојити. Генерално, код животиња 3. групе, величина ране се такође смањила, али су ивице ране остале поткопане.

Дакле, током упоредне студије брзине зарастања рана коришћењем фибробласт-сличних мезенхималних матичних ћелија и ембрионалних фибробласта, као и без употребе ћелијске терапије, примећено је убрзање брзине зарастања површине опекотине као резултат трансплантације фибробласт-сличних мезенхималних матичних ћелија и ембрионалних фибробласта. Међутим, у случају коришћења алогених фибробласт-сличних мезенхималних матичних ћелија, брзина зарастања рана била је већа него код трансплантације ембрионалних фибробласта. То се изразило у убрзању промене фаза регенеративног процеса - смањени су термини ћелијске инфилтрације, повећана је брзина раста васкуларне мреже, као и формирање гранулационог ткива.

Резултати динамичке планиметрије указују да је стопа спонтаног зарастања опекотинске ране (без употребе ћелијске терапије) била најнижа. 15. и 30. дана након трансплантације алогених мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима, стопа зарастања рана била је већа него код трансплантације ембрионалних фибробласта. Хистохемијска метода за детекцију бета-галактозидазе показала је да након трансплантације мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима и ембрионалних фибробласта, трансплантиране ћелије остају одрживе на површини и у дубини регенеришућих рана током целог периода посматрања. Аутори сматрају да је већа стопа регенерације опекотинске ране уз употребу мезенхималних матичних ћелија сличних фибробластима последица ослобађања биолошки активних фактора који стимулишу раст од стране ових ћелија током процеса сазревања.

Трансплантација ауто- или алогених кератиноцита и алогених фибробласта за лечење опекотина такође је коришћена у клиничкој пракси. Треба напоменути да је хируршко лечење деце са опсежним дубоким опекотинама сложен задатак због високе трауматичне природе и вишеструких хируршких интервенција, значајног губитка крви и различитих реакција на коришћене инфузионе медијуме. Главне тешкоће у извођењу пластичних операција коже код опсежних дубоких опекотина, са површином која прелази 40% површине тела, последица су тежине стања жртава и недостатка ресурса донорске коже. Употреба мрежастих трансплантата са високим коефицијентом перфорације не решава проблем, јер ћелије формиране након перфорације епителизују веома споро, а сами кожни режњеви често лизирају или се суше. Такви прекривачи опекотина као што су ксеноскин, кадаверични алографти, синтетички филмски прекривачи нису увек довољно ефикасни, стога се развијају нове методе прекривања површина опекотина слојевима култивисаних кератиноцита и фибробласта. Посебно је предложена метода покривања површина опекотина уз помоћ култивисаних алофибробласта, који, када се трансплантирају, имају изражен стимулативни ефекат на пролиферацију епидермоцита сачуваних у рани код граничних опекотина, као и кератиноцита у септама мрежастих трансплантата. Рад Л. Будкевича и коаутора (2000) представља резултате коришћења ове методе за лечење опекотина код деце. Студија је обухватила 31 дете са термичком траумом узраста од 1 године до 14 година. Код троје деце, укупна површина опекотина степена IIIA-B - IV била је 40%, код 25 - 50-70%, код још троје - 71-85% површине тела. Рана хируршка некректомија је комбинована са трансплантацијом култивисаних алофибробласта и аутодермопластиком. Прва фаза лечења обухватала је ексцизију некротичних ткива, друга фаза трансплантацију култивисаних алофибробласта на носаче филмова, а трећа фаза (48 сати након трансплантације култивисаних алофибробласта) уклањање матрикса и аутодермопластику кожним режњевима са односом перфорације 1:4. Код три пацијента примљена у клинику са тешком опекотинском болешћу, култивисани алофибробласти су трансплантирани на гранулирајуће ране. Трансплантација култивисаних алофибробласта је извршена једном код 18 деце, два пута код 11 деце и три пута код два пацијента. Површина површине ране прекривене ћелијском културом кретала се од 30 до 3500 цм2. Ефикасност култивисаних алофибробласта процењена је укупним процентом прихватања кожног калема, временом зарастања опекотина и бројем смртних случајева од тешке термичке трауме. Прихватање калема је било потпуно код 86% пацијената. Делимично неприхватање кожних калемова је забележено у 14% случајева. Упркос лечењу, шесторо (19,3%) деце је умрло. Укупна површина оштећења коже код њих кретала се од 40 до 70% површине тела.Трансплантација култивисаних алофибробласта није била повезана са морталитетом код опекотина ни код једног пацијента.

Анализирајући резултате лечења, аутори примећују да су претходно дубока термичка оштећења коже која су покривала 35-40% површине тела сматрана неспојивим са животом (за млађу децу - до 3 године - дубоке опекотине које покривају 30% површине тела су критичне, за старију децу - преко 40% површине тела). Приликом извођења хируршке некректомије са трансплантацијом култивисаних алофибробласта и накнадном аутодермопластиком кожним режњевима са високим коефицијентом перфорације, опекотине IIIB - IV степена остају критичне, али тренутно постоје изгледи за спасавање живота чак и таквих жртава у многим случајевима. Хируршка некректомија у комбинацији са трансплантацијом култивисаних алофибробласта и аутодермопластиком код деце са дубоким опекотинама показала се посебно ефикасном код пацијената са раширеним кожним лезијама са недостатком донорских места. Активна хируршка тактика и трансплантација култивисаних алофибробласта доприносе брзој стабилизацији општег стања таквих пацијената, смањењу броја инфективних компликација опекотинске болести, стварању повољних услова за прихватање трансплантата, смањењу времена обнављања изгубљене коже и трајања стационарног лечења, смањењу учесталости смртних исхода код жртава са опсежним опекотинама. Дакле, трансплантација култивисаних алофибробласта са накнадном аутодермопластиком кожним режњевима омогућава опоравак код деце са тешким опекотинама, која су раније сматрана осуђеним на пропаст.

Општеприхваћено је да је примарни циљ лечења опекотина што потпунија и бржа рестаурација оштећене коже како би се спречили токсични ефекти, инфективне компликације и дехидрација. Резултати коришћења култивисаних ћелија у великој мери зависе од спремности саме ране од опекотина за трансплантацију. У случајевима трансплантације култивисаних кератиноцита на површину ране након хируршке некректомије, у просеку се 55% (по површини) трансплантираних ћелија прихвати, док се код гранулирајућих рана стопа прихватања смањује на 15%. Стога, успешно лечење опсежних дубоких опекотина коже захтева, пре свега, активну хируршку тактику. У присуству опекотина IIIB-IV степена, површина опекотина се одмах ослобађа некротичног ткива како би се смањила интоксикација и смањио број компликација опекотина. Употреба такве тактике је кључ за смањење времена од тренутка добијања опекотина до затварања рана и дужине боравка пацијената са опсежним опекотинама у болници, а такође значајно смањује број смртних исхода.

Први извештаји о успешној употреби култивисаних кератиноцита за покривање површина опекотина појавили су се почетком 1980-их. Након тога, ова манипулација је извођена коришћењем слојева култивисаних кератиноцита, најчешће добијених из аутоћелија, много ређе из алокератиноцита. Међутим, технологија аутокератиноцитопластике не дозвољава стварање ћелијске банке, док је време потребно за производњу трансплантата кератиноцита довољне површине дуго и износи 3-4 недеље. Током овог периода, ризик од развоја инфективних и других компликација болести опекотина нагло се повећава, што значајно продужава укупно време боравка пацијената у болници. Поред тога, аутокератиноцити практично не пуштају корен када се трансплантирају на гранулирајуће ране од опекотина, а висока цена специјалних медија за раст и биолошки активних стимулатора раста кератиноцита значајно ограничава њихову клиничку употребу. Друге биотехнолошке методе, као што су колагенопластика, трансплантација криоконзервиране ксенокоже и употреба различитих биополимерних премаза повећавају ефикасност лечења опсежних површинских, али не и дубоких опекотина. Метода покривања површине ране култивисаним фибробластима је фундаментално другачија по томе што се фибробласти, а не кератиноцити, користе као главна компонента култивисаног ћелијског слоја.

Предуслов за развој методе био је податак да су перицити који окружују мале крвне судове прогениторске мезенхималне ћелије способне да се трансформишу у фибробласте који производе многе факторе раста и обезбеђују зарастање рана због снажног стимулативног ефекта на пролиферацију и адхезију кератиноцита. Употреба култивисаних фибробласта за затварање површина рана одмах је открила низ значајних предности ове методе у поређењу са употребом култивисаних кератиноцита. Конкретно, добијање фибробласта у култури не захтева употребу посебних хранљивих медија и стимуланса раста, што смањује трошкове трансплантата за више од 10 пута у поређењу са трошковима добијања кератиноцита. Фибробласти се лако пасивизирају, током чега делимично губе површинске антигене хистокомпатибилности, што заузврат отвара могућност коришћења алогених ћелија за производњу трансплантата и стварање њихових банака. Време потребно за добијање трансплантата спремних за употребу у клиници смањено је са 3 недеље (за кератиноците) на 1-2 дана (за фибробласте). Примарна култура фибробласта може се добити култивисањем ћелија из фрагмената коже узетих током аутодермопластике, а густина сетве ћелија за добијање субкултура људских фибробласта је само 20 x 10³ ^по 1 ^cm².

Ради проучавања утицаја фибробласта и њихових регулаторних протеина на пролиферацију и диференцијацију кератиноцита, спроведена је упоредна анализа морфологије и пролиферације кератиноцита на супстратима колагена типа I и III, као и фибронектина у заједничкој култури са људским фибробластима. Људски кератиноцити су изоловани из фрагмената коже пацијената са опекотинама, узетих током аутодермопластике. Густина сетве кератиноцита била је 50 x 10³ ћелија на 1 cm². Клиничка ефикасност трансплантације култивисаних фибробласта процењена је код 517 пацијената. Сви пацијенти су подељени у две групе: Група 1 - одрасли жртве са опекотинама IIA, B - IV степена; Група 2 - деца са дубоким опекотинама IIIB - IV степена. Процена динамике структурне и функционалне организације фибробласта монослојне културе, узимајући у обзир улогу гликозаминогликана, фибронектина и колагена у процесима регенерације, омогућила је ауторима да одреде 3. дан као најповољнији период за коришћење култура фибробласта за израду трансплантата. Студија утицаја фибробласта на пролиферацију и диференцијацију кератиноцита показала је да ин витро фибробласти имају изражен стимулативни ефекат, првенствено на процесе адхезије кератиноцита, повећавајући број причвршћених ћелија и брзину њихове фиксације за више од 2 пута. Стимулација процеса адхезије праћена је повећањем интензитета синтезе ДНК и нивоа пролиферације кератиноцита. Поред тога, испоставило се да је присуство фибробласта и екстрацелуларног матрикса који они формирају неопходан услов за формирање тонофибриларног апарата кератиноцита, међућелијских веза и, на крају крајева, за диференцијацију кератиноцита и формирање базалне мембране. У лечењу деце са дубоким опекотинама утврђена је висока клиничка ефикасност трансплантације културе алофибробласта, посебно у групи пацијената са опсежним лезијама коже у условима дефицита донорског места. Свеобухватна морфофункционална студија показала је да се трансплантирани фибробласти карактеришу активном синтезом ДНК, као и колагена, фибронектина и гликозаминогликана, који су део екстрацелуларног матрикса који формирају ћелије. Аутори указују на висок проценат прихватања трансплантираних фибробласта (до 96%), нагло смањење времена њиховог пријема (у року од 24-48 сати уместо 2-3 недеље у случају коришћења кератиноцита), значајно убрзање епителизације површине опекотине, као и значајно смањење трошкова (за 10 пута) технологије узгоја трансплантата из фибробласта у поређењу са трансплантацијом кератиноцита. Употреба трансплантације култивисаних алофибробласта омогућава спасавање живота деце са критичним опекотинама - термичким оштећењем више од 50% површине тела,што се раније сматрало неспојивим са животом. Треба напоменути да је трансплантацијом алогених ембрионалних фибробласта убедљиво доказана не само бржа регенерација рана и опоравак пацијената са различитим степеном и површинама опекотина, већ и значајно смањење њихове смртности.

Аутологни фибробласти се такође користе у тако сложеној области пластичне хирургије као што је реконструктивна корекција повреда гласних жица. У ту сврху се обично користи говеђи колаген, чије је трајање деловања ограничено његовом имуногеношћу. Будући да је страни протеин, говеђи колаген је осетљив на колагеназу примаоца и може изазвати имуне реакције, а да би се смањио ризик од тога, развијене су технологије за добијање колагенских препарата умрежених глутаралдехидом. Њихова предност лежи у већој стабилности и мањој имуногености, што је нашло практичну примену у отклањању дефеката и атрофије гласних жица. Ињекције аутологног колагена први пут су коришћене 1995. године. Техника је обезбедила очување примарне структуре аутологних колагенских влакана, укључујући интрамолекуларне ензимски катализоване унакрсне везе. Чињеница је да су природна колагенска влакна отпорнија на уништење протеазама него реконституисани колаген, у коме су телопептиди пресечени. Интегритет телопептида је важан за кватернарну структуру колагенских влакана и формирање унакрсних веза између суседних молекула колагена. За разлику од препарата говеђег колагена, аутологни колаген не изазива имуне реакције код примаоца, али није довољно ефикасан као средство за надокнаду. Стабилна корекција може се постићи локалном производњом колагена трансплантацијом аутологних фибробласта. Међутим, одређене потешкоће су идентификоване током проучавања ефикасности аутологне трансплантације фибробласта у клиници. У раном периоду након трансплантације фибробласта, клинички ефекат је био слабији у поређењу са оним након увођења говеђег колагена. Приликом култивације аутологних фибробласта, не може се искључити могућност трансформације нормалних фибробласта у патолошке, такозване миофибробласте, одговорне за развој фиброзе и формирање ожиљака, што се види по контракцији колагенског гела изазваној специфичном интеракцијом фибробласта и колагенских фибрила. Поред тога, након серијског пасирања in vitro, фибробласти губе способност да синтетишу протеине екстрацелуларног матрикса.

Међутим, сада је експериментално развијена метода за култивацију аутологних људских фибробласта која елиминише горе поменуте недостатке и не доводи до онкогене трансформације нормалних фибробласта. Аутологни фибробласти добијени овом методом користе се за рестаурацију дефеката у меким ткивима лица. У студији Г. Келера и др. (2000), третирано је 20 пацијената старости од 37 до 61 године са борама и атрофичним ожиљцима. Биопсије коже (4 мм) из ретроаурикуларне регије транспортоване су у лабораторију у стерилним епруветама које су садржале 10 мл подлоге за култивацију (Иглов медијум са антибиотиком, микосептиком, пируватом и феталним телећим серумом). Материјал је стављен у 3-5 посуда за култивацију пречника 60 мм и инкубиран у термостату са атмосфером која садржи 5% CO2. Након 1 недеље, ћелије су уклоњене из посуда трипсинизацијом и стављене у бочице од 25 цм2. Ћелије су убризгане пацијентима у количини од 4 x 107. Значајан и упоран клинички ефекат је примећен код пацијената током корекције назолабијалних набора, као и код пацијената са ожиљцима 7 и 12 месеци након треће трансплантације аутологних фибробласта. Према проточној цитометрији, култивисани фибробласти су произвели велику количину колагена типа I. Студије ин витро су показале нормалну контрактилност убризганих фибробласта. Два месеца након поткожне примене култивисаних фибробласта у дози од 4 x 107 ћелија, нису откривени тумори код голих мишева. Убризгани фибробласти нису изазвали ожиљке или дифузну фиброзу код пацијената. Према речима аутора, калемљени аутологни фибробласти су способни да константно производе колаген, што ће обезбедити козметички ефекат подмлађивања. Истовремено, пошто је животни век диференцираних ћелија ограничен, фибробласти узети од младог пацијента су ефикаснији од оних добијених од старијих особа. У будућности се претпоставља да ће бити могуће криопрезервирати културу фибробласта узетих од младог донора како би се касније сопствене младе ћелије трансплантирале старијем пацијенту. Закључно, није сасвим тачно закључити да су аутологни фибробласти, под условом да су функционално очувани, идеално средство за исправљање дефеката меких ткива лица. Истовремено, сам аутор напомиње да су се током студије појавиле неке проблематичне ситуације везане за употребу аутологног система фибробласт-колаген. Клинички ефекат је често био слабији него код употребе говеђег колагена, што је изазвало разочарање код пацијената.

Генерално, подаци из литературе о изгледима за клиничку употребу мезенхималних матичних ћелија изгледају прилично оптимистично. Чине се покушаји да се користе аутологне мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије коштане сржи за лечење дегенеративних лезија зглобова. Спроводе се прва клиничка испитивања употребе култивисаних мезенхималних прогениторских ћелија у лечењу сложених прелома костију. Ауто- и алогене мезенхималне стромалне ћелије коштане сржи користе се за стварање хрскавичног ткива за трансплантацију у корекцији дефеката зглобне хрскавице услед трауме или аутоимуних лезија. Развијају се методе за клиничку употребу мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија за елиминацију коштаних дефеката код деце са тешким обликом непотпуне остеогенезе изазване мутацијама у гену за колаген типа I. Након мијелоаблације, деци примаоцима се трансплантира коштана срж од HLA-компатибилних здравих донора, пошто нефракционисана коштана срж може да садржи довољан број мезенхималних матичних ћелија да компензује тежак коштани дефект. Након трансплантације алогене коштане сржи, код такве деце су уочене позитивне хистолошке промене у трабекуларним костима, повећање стопе раста и смањење учесталости прелома костију. У неким случајевима, позитиван клинички резултат се постиже трансплантацијом блиско сродне алогене коштане сржи и остеобласта. Трансплантација мезенхималних стволних ћелија (МСЦ) се такође користи за лечење конгениталне крхкости костију изазване неравнотежом остеобласта и остеокласта у коштаном ткиву. У овом случају, обнављање формирања костију се постиже химеризацијом фонда матичних и прогениторских стромалних ћелија у коштаном ткиву пацијената.

Наставља се унапређење метода генетске модификације донорских мезенхималних матичних ћелија у сврху корекције генетских дефеката стромалних ткива. Претпоставља се да ће се у блиској будућности мезенхималне прогениторске ћелије користити у неурологији за циљану химеризацију можданих ћелија и стварање здравог пула ћелија способних да генеришу дефицитарни ензим или фактор одговоран за клиничке манифестације болести. Трансплантација мезенхималних матичних ћелија може се користити за рестаурацију строме коштане сржи код пацијената оболелих од рака након радио- и хемотерапије, а у комбинацији са ћелијама коштане сржи - за рестаурацију хематопоезе. Развој супституционе терапије усмерене на елиминацију дефеката мишићно-скелетног система уз помоћ МСК промовише се инжењерским развојем у области пројектовања матричних биоматеријала или биомиметика који формирају оквире насељене потомством мезенхималних матичних ћелија.

Извори мезенхималних матичних ћелија

Главни извор мезенхималних матичних ћелија је коштана срж, чије се хематопоетске матичне ћелије у телу сисара стално диференцирају у ћелије крви и имуног система, док су мезенхималне матичне ћелије представљене малом популацијом ћелија строме коштане сржи сличних фибробластима и доприносе очувању недиференцираног стања хематопоетских матичних ћелија. Под одређеним условима, мезенхималне матичне ћелије се диференцирају у ћелије хрскавице и коштаног ткива. Када се посеју на медијум за култивацију под условима ниске густине садње, мононуклеарне стромалне ћелије коштане сржи формирају колоније адхезивних ћелија, које су, у ствари, мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије сличне фибробластима. Неки аутори сматрају да се у коштаној сржи таложе некомбиноване мезенхималне матичне ћелије, које, због своје способности самообнављања и високог потенцијала диференцијације, обезбеђују сва ткива тела мезенхималним прекурсорима стромалних елемената током целог живота организма сисара.

У коштаној сржи, стромални ћелијски елементи формирају мрежу која испуњава простор између синусоида и коштаног ткива. Садржај успаваних МСК у коштаној сржи одрасле особе је упоредив са количином хематопоетских матичних ћелија и не прелази 0,01-0,001%. Мезенхималне матичне ћелије изоловане из коштане сржи и које нису подвргнуте култивацији лишене су молекула адхезије. Такве МСК не експресују CD34, ICAM, VCAM, колаген типова I и III, CD44 и CD29. Сходно томе, in vitro, нису мезенхималне матичне ћелије фиксиране на супстрату културе, већ напреднији прогениторски деривати мезенхималних матичних ћелија који су већ формирали компоненте цитоскелета и рецепторски апарат молекула ћелијске адхезије. Стромалне ћелије са CD34 фенотипом налазе се чак и у периферној крви, иако их је у коштаној сржи знатно мање него CD34-позитивних мононуклеарних ћелија. CD34 ћелије изоловане из крви и пренете у културу везују се за супстрат и формирају колоније ћелија сличних фибробластима.

Познато је да у ембрионалном периоду стромална основа свих органа и ткива сисара и људи настаје из заједничког фонда мезенхималних матичних ћелија пре и у фази органогенезе. Стога се сматра да би у зрелом организму већина мезенхималних матичних ћелија требало да се налази у везивном и коштаном ткиву. Утврђено је да главни део ћелијских елемената строме растреситог везивног и коштаног ткива представљају посвећене прогениторске ћелије, које, међутим, задржавају способност пролиферације и формирања клонова in vitro. Када се такве ћелије унесу у општи крвоток, више од 20% мезенхималних прогениторских ћелија се имплантира међу стромалне елементе хематопоетског ткива и паренхиматозних органа.

Потенцијални извор мезенхималних матичних ћелија је масно ткиво, међу чијим матичним ћелијама су идентификовани прекурсори адипоцита у различитом степену посвећености. Најмање зрели прогениторски елементи масног ткива су стромално-васкуларне ћелије, које су, попут мултипотентних мезенхималних прекурсорских ћелија коштане сржи, способне да се диференцирају у адипоците под утицајем глукокортикоида, инсулину сличног фактора раста и инсулина. У култури, стромално-васкуларне ћелије се диференцирају у адипоците и хондроците, а у масном ткиву пореклом из коштане сржи постоје ћелије које формирају адипоците и остеобласте.

Стромалне матичне ћелије су такође пронађене у мишићима. У примарној култури ћелија изолованих из људских скелетних мишића, детектују се стелатне ћелије и вишеједарне миотубе. У присуству коњског серума, стелатне ћелије пролиферишу in vitro без знакова цитодиференцијације, а након додавања дексаметазона у хранљиву подлогу, њихова диференцијација се карактерише појавом ћелијских елемената са фенотипом ћелија скелетних и глатких мишића, костију, хрскавице и масног ткива. Стога су у људском мишићном ткиву присутне и посвећене и некомитиране мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије. Показано је да популација прогениторских ћелија присутних у скелетним мишићима потиче од некомитованих мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија коштане сржи и разликује се од миогених сателитских ћелија.

Адхезивне звездасте ћелије које одговарају мултипотентним мезенхималним прогениторским ћелијама по потенцијалу диференцијације такође су пронађене у миокарду новорођених пацова, јер се под утицајем дексаметазона диференцирају у адипоците, остеобласте, хондроците, ћелије глатких мишића, миотубе скелетних мишића и кардиомиоците. Показано је да су ћелије васкуларних глатких мишића (перицити) деривати недиференцираних периваскуларних мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија. У култури, периваскуларне мезенхималне матичне ћелије експресују α-актин глатких мишића и рецептор фактора раста изведеног из тромбоцита и способне су да се диференцирају барем у ћелије глатких мишића.

Посебно место, са становишта резерви стабљике, заузима хрскавично ткиво, чији се изузетно низак репаративни потенцијал сматра последицама недостатка мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора или фактора диференцијације и раста. Претпоставља се да мултипотентне мезенхималне ћелије прогенитора претходно посвећене хондро- и остеогенези улазе у хрскавично ткиво из других извора ткива.

Порекло ткива и услови ангажовања мезенхималних прогениторских ћелија у тетивама такође нису утврђени. Експериментална запажања указују да у раном постнаталном периоду ћелије Ахилове тетиве зеца у примарним културама и при првом пасажу задржавају експресију колагена типа I и декорина, али даљом култивацијом губе маркере диференцијације теноцита.

Треба напоменути да одговор на питање да ли су мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије локализоване у различитим ткивима заправо стално присутне у њиховој строми или се ткивни пул мезенхималних матичних ћелија обнавља миграцијом стромалних матичних ћелија коштане сржи, још увек није добијен.

Поред коштане сржи и других мезенхималних ткивних зона одраслог организма, крв из пупчане врпце може бити још један извор МСК. Показано је да крв из вене пупчане врпце садржи ћелије које имају сличне морфолошке и антигене карактеристике са мултипотентним мезенхималним прогениторским ћелијама, способне су за адхезију и нису инфериорне у односу на мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије порекла из коштане сржи у потенцијалу диференцијације. У културама мезенхималних матичних ћелија из крви из пупчане врпце пронађено је 5 до 10% некомбинованих мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија. Испоставило се да је њихов број у крви из пупчане врпце обрнуто пропорционалан гестацијској старости, што индиректно указује на миграцију мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија у различита ткива током феталног развоја. Појавиле су се прве информације о клиничкој употреби мезенхималних матичних ћелија изолованих из крви из пупчане врпце, као и оних добијених из ембрионалног биоматеријала, што се заснива на познатој способности феталних матичних ћелија да се интегришу, прилагоде и функционишу у органима и ткивним системима одраслих прималаца.

Потрага за новим изворима мезенхималних матичних ћелија

Употреба мезенхималних матичних ћелија ембрионалног порекла, као и других феталних ћелија, ствара низ етичких, правних, судских и законодавних проблема. Стога се наставља потрага за екстраембрионским донорским ћелијским материјалом. Покушај клиничке употребе фибробласта људске коже био је неуспешан, што је било предодређено не само високим финансијским капацитетом технологије, већ и брзом диференцијацијом фибробласта у фиброците, који имају значајно нижи пролиферативни потенцијал и производе ограничен број фактора раста. Даљи напредак у проучавању биологије МСК и мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора коштане сржи омогућио нам је да развијемо стратегију за клиничку употребу аутологних мезенхималних матичних ћелија. Технологија њихове изолације, култивације, ex vivo репродукције и циљане диференцијације захтевала је, пре свега, проучавање спектра молекуларних маркера МСК. Њихова анализа је показала да примарне културе људског коштаног ткива садрже неколико врста мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора. Проостеобластни фенотип је детектован у ћелијама које експресују маркер стромалних прогениторских ћелија STRO-1, али не носе остеобластни маркер - алкалну фосфатазу. Такве ћелије карактерише ниска способност формирања минерализованог коштаног матрикса, као и одсуство експресије остеопонтина и рецептора паратироидног хормона. Деривати STRO-1-позитивних ћелија који не експресују алкалну фосфатазу представљени су средње и потпуно диференцираним остеобластима. Утврђено је да су ћелијски елементи клонираних линија STRO-1-позитивних људских трабекуларних коштаних ћелија способни да се диференцирају у зреле остеоците и адипоците. Правац диференцијације ових ћелија зависи од дејства полинезасићених масних киселина, проинфламаторних цитокина - IL-1b и фактора некрозе тумора a (TNF-a), као и антиинфламаторног и имуносупресивног TGF-b.

Касније је утврђено да мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије немају специфичан фенотип својствен само њима, али експресују комплекс маркера карактеристичних за мезенхималне, ендотелне, епителне и мишићне ћелије у одсуству експресије имунофенотипских антигена хематопоетских ћелија - CD45, CD34 и CD14. Поред тога, мезенхималне матичне ћелије конститутивно и индуцибилно производе хематопоетске и нехематопоетске факторе раста, интерлеукине и хемокине, а рецептори за неке цитокине и факторе раста се експресују на мултипотентним мезенхималним прогениторским ћелијама. Дормантне, или ћелије у мировању, са имунофенотипом готово идентичним антигенском профилу мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија нетретираних 5-флуороурацилом пронађене су међу ћелијама стромалног матрикса људског тела - обе ћелије експресују CD117, који означава „одрагле“ матичне ћелије.

Дакле, ћелијски маркер јединствен за мезенхималне матичне ћелије још увек није идентификован. Претпоставља се да мирујуће ћелије представљају популацију некомитираних мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија, пошто не експресују маркере ћелија посвећених остео- (Cbfa-1) или адипогенези (PPAR-y-2). Дуготрајно излагање споро пролиферирајућих мирујућих ћелија феталном говеђем серуму доводи до формирања терминално диференцирајућих посвећених прогениторских ћелија које карактерише брзи раст. Клоналну експанзију таквих мезенхималних матичних ћелија подржава FGF2. Чини се да је геном стромалних матичних ћелија прилично чврсто „затворен“. Постоје извештаји о одсуству спонтане диференцијације у MSC - без посебних услова за обавезивање, оне се не трансформишу чак ни у ћелије мезенхималне лозе.

Да би се проучила популациона структура деривата мезенхималних матичних ћелија, спроводи се потрага за протеинима маркера диференцијације на стромалним ћелијским линијама и у примарним културама. Ин витро клонална анализа ћелија коштане сржи које формирају колоније показала је да ЕГФ повећава просечну величину колоније и смањује клоналну експресију алкалне фосфатазе када се примени на примарне културе, док додатак хидрокортизона активира експресију алкалне фосфатазе, која је маркер остеогеног правца диференцијације МСК. Моноклонална антитела на STRO-1 омогућила су одвајање и проучавање популације STRO-1-позитивних адхезивних ћелија у хетерогеном систему Декстер култура. Утврђен је спектар цитокина који регулишу не само пролиферацију и диференцијацију хематопоетских и лимфоидних ћелија, већ учествују и у формирању, формирању и ресорпцији скелетних ткива путем пара-, ауто- и ендокриних механизама. Рецептором посредовано ослобађање секундарних гласника као што су цАМП, диацилглицерол, инозитол трифосфат и Ca2+ такође се користи за анализу маркера различитих категорија ћелија стромалног ткива које експресују одговарајуће рецепторе. Употреба моноклонских антитела као маркера омогућила је утврђивање припадности ретикуларних ћелија строме лимфоидних органа Т- и Б-зависним зонама.

Неко време су се водиле научне дебате око питања могућности порекла МСК из хематопоетских матичних ћелија. Заиста, када се суспензије ћелија коштане сржи експлантирају у монослојне културе, у њима расту дискретне колоније фибробласта. Међутим, показано је да присуство прекурсора фибробластних колонија и различитих клица диференцијације хематопоетског ткива у коштаној сржи није доказ њиховог заједничког порекла из хематопоетске матичне ћелије. Коришћењем дискриминантне анализе матичних ћелија коштане сржи, утврђено је да микроокружење током хетеротопске трансплантације коштане сржи није пренето хематопоетским ћелијама, што доказује постојање популације МСК у коштаној сржи која је хистогенетски независна од хематопоетских ћелија.

Поред тога, метод селективног клонирања омогућио је идентификацију нове категорије стромалних ћелија прогенитора у монослојним културама ћелија коштане сржи, одређивање њиховог броја и проучавање њихових својстава, пролиферативних и диференцијационих потенцијала. Испоставило се да се ћелије сличне стромалним фибробластима размножавају in vitro и формирају диплоидне колоније, које, када се поново трансплантирају у тело, обезбеђују формирање нових хематопоетских органа. Резултати проучавања појединачних клонова указују на то да међу стромалним ћелијама прогенитора постоји популација ћелија које својим пролиферативним и диференцијационим потенцијалом могу да преузму улогу матичних ћелија стромалног ткива, хистогенетски независних од хематопоетских матичних ћелија. Ћелије ове популације карактерише самоодржив раст и диференцирају се у елементе ћелија прогенитора костију, хрскавице и ретикуларног ткива коштане сржи.

Од великог интереса су резултати студија Р. Чајлакјана и коаутора (1997-2001), који су култивисали ћелије прогенитора строме коштане сржи зечева, замораца и мишева на a-MEM хранљивој подлози са додатком феталног телећег серума. Аутори су извршили експлантацију са почетном густином од 2-4 x 10³ ћелија коштане сржи на 1 cm². Хомологне или хетерологне ћелије коштане сржи инактивиране зрачењем коришћене су као хранилица у дози која је задржала ефекат хранилице, али је потпуно блокирала њихову пролиферацију. Двонедељне примарне дискретне колоније фибробласта су трипсинизоване да би се добили моноклонски сојеви. Докази о клоналном пореклу колонија добијени су коришћењем хромозомског маркера у мешовитим културама коштане сржи мужјака и женки замораца, убрзаним фотографисањем живих култура и у мешовитим културама сингене коштане сржи мишева CBA и CBAT6T6. Трансплантација суспензије свеже изолованих ћелија коштане сржи или ин витро узгајаних стромалних фибробласта испод бубрежне капсуле извршена је у порозним скеловима од ивалона или желатина, као и у инактивираном сунђерастом коштаном матриксу зеца. За трансплантацију клонова у коштани омотач, бутне кости заморчића су очишћене од меког ткива и периоста, епифизе су обрезане, а коштана срж је темељно испрана. Кост је исечена на фрагменте (3-5 мм), осушена и озрачена дозом од 60 Gy. Појединачне колоније фибробласта су стављене у коштане омотаче и имплантиране интрамускуларно. За интраперитонеалну трансплантацију стромалних фибробласта узгајаних ин витро коришћене су дифузионе коморе типа А (V=0,015 цм3, h=0,1 мм) и О (V=0,15 цм3, h=2 мм).

Приликом проучавања динамике раста клонских сојева, Р. Чајлакјан и др. (2001) су открили да појединачне ћелије које формирају колоније фибробласта, као и њихови потомци, имају огроман пролиферативни потенцијал. До 10. пасажа, број фибробласта код неких сојева је био 1,2-7,2 x 10 ⁹ ћелија. Током свог развоја, извршили су и до 31-34 удвостручења ћелија. У овом случају, хетеротопска трансплантација сојева изведених из коштане сржи, формираних од стромалних прекурсора неколико десетина клонова, резултирала је преносом микроокружења коштане сржи и формирањем новог хематопоетског органа у зони трансплантације. Аутори су поставили питање да ли су појединачни клонови способни да пренесу микроокружење коштане сржи стромалних ћелија или је за то потребна сарадња неколико различитих клоногених стромалних прекурсора? И ако су појединачни клонови способни да пренесу микроокружење, да ли ће оно бити потпуно за сва три хематопоетска клица, или различити клонови обезбеђују формирање микроокружења за различите хематопоетске клице? Да би се решили ови проблеми, развијена је технологија за култивацију стромалних прогениторских ћелија на колагенском гелу, што омогућава уклањање узгајаних колонија фибробласта са површине ради накнадне хетеротопске трансплантације. Појединачни клонови стромалних фибробласта узгајаних из ћелија коштане сржи CBA мишева и замораца су исечени заједно са фрагментом гел премаза и хетеротопски трансплантирани - испод бубрежне капсуле сингених мишева или у трбушни мишић аутологних замораца. Приликом трансплантације у мишић, колоније на гелу су смештене у коштане овојнице.

Аутори су открили да је 50-90 дана након трансплантације колонија фибробласта коштане сржи, у зони трансплантације у 20% случајева примећен развој коштаног или коштаног и хематопоетског ткива. Код 5% животиња прималаца, формирана жаришта коштаног ткива садржала су шупљину испуњену коштаном сржи. Унутар коштаних цилиндара, таква жаришта су имала заобљен облик и капсулу изграђену од коштаног ткива са остеоцитима и добро развијеним остеобластним слојем. Шупљина коштане сржи садржала је ретикуларно ткиво са мијелоидним и еритроидним ћелијама, чији се пропорционални однос није разликовао од оног у нормалној коштаној сржи. У бубрегу, трансплантат је био типичан орган коштане сржи формиран током трансплантације нативне коштане сржи, при чему је коштана капсула покривала шупљину коштане сржи само са стране бубрежне капсуле. Хематопоетско ткиво је обухватало мијелоидне, еритроидне и мегакариоцитне елементе. Строма шупљине коштане сржи имала је добро развијен синусни систем и садржала је типичне масне ћелије. Истовремено, коштано ткиво без знакова хематопоезе пронађено је у зони трансплантације неких колонија испод капсуле бубрега. Проучавање пролиферативних и диференцијационих потенцијала појединачних клонова настављено је на моноклонским сојевима коштане сржи зечева, чије су ћелије ресуспендоване у хранљивој подлози и у посебном ивалон сунђеру масе 1-2 мг трансплантиране су испод бубрежне капсуле донора коштане сржи зеца. Ћелије 21 моноклонског соја подвргнуте су таквој аутотрансплантацији. Резултати су узети у обзир након 2-3 месеца. Аутори су открили да су у 14% случајева трансплантирани моноклонски сојеви формирали орган коштане сржи који се састоји од коштаног ткива и шупљине коштане сржи испуњене хематопоетским ћелијама. У 33% случајева, трансплантирани сојеви формирали су компактну кост различите величине са остеоцитима уграђеним у шупљине и развијеним остеобластним слојем. У неким случајевима, ретикуларно ткиво без коштаних или хематопоетских елемената развило се у сунђерима са трансплантираним клоновима. Понекад је формирана ретикуларна строма са добро развијеном мрежом синусоида, али није насељена хематопоетским ћелијама. Дакле, добијени резултати били су слични подацима добијеним током трансплантације клонова на колагенски гел. Међутим, ако је трансплантација клонова узгајаних на подлози резултирала формирањем ткива коштане сржи у 5% случајева, коштаног ткива у 15% и ретикуларног ткива у 80% случајева, онда је код трансплантације моноклонских сојева формирање елемената коштане сржи примећено у 14% случајева, коштаног ткива у 53% и ретикуларног ткива у 53% случајева. Према ауторима, ово указује да су услови за реализацију пролиферативног и диференцијационог потенцијала стромалних фибробласта током трансплантације на порозне скеле били оптималнији него током њихове трансплантације у коштане омотаче и на колагенску подлогу.Могуће је да употреба напреднијих метода култивације и реверзне трансплантације клонова може побољшати услове за реализацију њиховог потенцијала диференцијације од стране клонова и променити ове односе. На овај или онај начин, али главни значај спроведених студија је да су неки клонови стромалних ћелија способни да формирају коштано ткиво и истовремено обезбеде стромалну хематопоетску микросредину за три клице хематопоезе коштане сржи одједном: еритроидну, мијелоидну и мегакариоцитну, стварајући прилично велике платформе хематопоетског ткива и извесну коштану масу.

Аутори су се затим бавили питањем способности појединачних клоногених ћелија прогенитора строме да прођу кроз ове типове ћелијске диференцијације у затвореном систему дифузионих комора. Поред тога, било је потребно утврдити да ли појединачни клонови поседују полипотентност или испољавање потенцијала диференцијације захтева кооперативну интеракцију неколико клонова са фиксном особином цитодиференцијације, чији различити односи одређују преференцијално формирање коштаног, ретикуларног или хрскавичног ткива. Комбиновањем два методолошка приступа - добијањем моноклонских сојева ћелија прогенитора строме коштане сржи и њиховим пресађивањем у дифузионе коморе - Р. Чајлакјан и коаутори (2001) добили су резултате који су им омогућили да се приближе разумевању структурне организације строме коштане сржи. Трансплантација моноклонских сојева ћелија прогенитора строме у коморе О-типа резултирала је формирањем и коштаног и хрскавчаног ткива, што указује на способност потомака једне ћелије која формира колоније строме да истовремено формирају коштано и хрскавчано ткиво. Претпоставка да коштано и хрскавчано ткиво потичу од заједничке ћелије прогенитора строме више пута је изношена. Међутим, ова хипотеза није имала тачну експерименталну потврду. Формирање костију и хрскавице у дифузионим коморама био је неопходан доказ постојања заједничке ћелије прекурсора за ове две врсте ткива међу матичним ћелијама строме коштане сржи.

Затим је 29 клонских сојева друге и треће пасаже добијених из примарних култура коштане сржи зеца смештено у дифузионе коморе и имплантирано интраперитонеално у хомологне животиње. Студије су показале да 45% моноклонских сојева коштане сржи поседује остеогени потенцијал. Девет комора је садржало искључиво ретикуларно ткиво, али је оно било присутно заједно са коштаним и хрскавичним ткивом у још 13 комора, што је чинило 76% свих сојева. У коморама типа О, где је била могућа диференцијација и коштаног и хрскавичног ткива, проучавано је 16 сојева. У четири коморе (25%) формирано је и коштано и хрскавично ткиво. Треба још једном напоменути да су у студијама Р. Чајлакјана и др. (2001) појединачне прогениторске ћелије прошле кроз 31 до 34 удвостручења унутар ћелијског соја, а њихово потомство је обухватало 0,9-2,0 x 109 ^ћелија. Број митоза које су прогениторске ћелије поликлонских сојева прошле био је практично идентичан броју моноклонских сојева. Брзина развоја поликлоналних сојева, посебно у првој фази њиховог формирања, у значајној мери је зависила од броја колонија коришћених за иницирање сојева. Диплоидни сојеви људских ембрионалних фибробласта (WI-38), када су реклонирани на нивоима удвостручавања 12-15, такође су формирали колоније које су се разликовале у пречнику и садржају ћелија. Велике колоније које су садржале више од 10³ ћелија чиниле су само 5-10%. Са повећањем броја деоба, проценат великих колонија се смањивао. Моно- и поликлонални сојеви стромалних фибробласта коштане сржи задржали су диплоидни сет хромозома након 20 или више удвостручавања, а тенденција њиховог развоја била је упоредива са динамиком развоја диплоидних сојева ембрионалних фибробласта. Анализа потенцијала диференцијације појединачних ћелија прогенитора строме коштане сржи, спроведена трансплантацијом моноклоналних сојева у дифузионе коморе, показала је да је половина њих била остеогена. Велике колоније чиниле су 10% њиховог укупног броја. Сходно томе, број остеогених ћелија које формирају колоније одговарао је приближно 5% њихове укупне популације. Укупна маса остеогених ћелија прогенитора које су аутори идентификовали обухватала је ћелије способне да истовремено формирају коштано и хрскавично ткиво. Штавише, први пут је утврђено да ове две врсте ткива у одраслом организму имају заједничку ћелију прогенитора: 25% тестираних клонова су створиле такве ћелије, а њихов број међу укупном популацијом ћелија прогенитора био је најмање 2,5%.

Дакле, хетеротопска трансплантација појединачних клонова фибробласта коштане сржи открила је нове аспекте структурне организације популације мезенхималних ћелија прогенитора. Пронађене су стромалне ћелије прогенитора које су способне да преносе специфично микроокружење за све хематопоетске клице одједном, чији се број међу великим клоновима проучаваним у различитим моделима креће од 5 до 15% (0,5-1,5% од укупног броја детектованих ћелија прогенитора). Уз клонове који преносе комплетно микроокружење коштане сржи, постоје ћелије прогенитора одређене само за остеогенезу, које, када се преносе у отворени систем, формирају коштано ткиво које не подржава развој хематопоезе. Њихов број од укупног броја ћелија прогенитора је 1,5-3%. Неке од ових ћелија су способне да формирају коштано ткиво са ограниченим периодом самоодржавања. Сходно томе, популација стромалних ћелија прогенитора је хетерогена у свом потенцијалу диференцијације. Међу њима постоји категорија ћелија које тврде да су стромалне матичне ћелије, способне да се диференцирају у сва три правца карактеристична за стромалну ткиву коштане сржи, формирајући коштано, хрскавично и ретикуларно ткиво. Представљени подаци нам омогућавају да се надамо да ће, користећи различите ћелијске маркере, бити могуће утврдити допринос сваке врсте стромалних ћелија организацији специфичног микроокружења и подршци хематопоезе у Декстер културама.

Карактеристике мезенхималних матичних ћелија

Последњих година је утврђено да су у стационарним културама коштане сржи мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије представљене ограниченом популацијом малих агрануларних ћелија (RS-1 ћелије) које карактерише низак капацитет формирања колонија и одсуство експресије Ki-67 антигена специфичног за пролиферирајуће ћелије. Антигени параметри успаваних RS-1 ћелија разликују се од спектра антигена брзо пролиферирајућих посвећених стромалних прогениторских ћелија. Утврђено је да се висока стопа пролиферације посвећених прогениторских ћелија примећује само у присуству RS-1 ћелија. Заузврат, RS-1 ћелије повећавају своју стопу раста под утицајем фактора које луче најзрелији деривати мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија. Чини се да су RS-1 ћелије подкласа неопредељених MSC способних за рециклажу. Ин витро, 5-флуороурацил-резистентне стромалне прогениторске ћелије коштане сржи карактеришу се ниским садржајем РНК и високом експресијом гена орнитин декарбоксилазе, маркера ћелија које се не пролиферишу.

Интензивна пролиферација стромалних прогениторских ћелија почиње након њихове фиксације на супстрату. У овом случају, изражен је маркерски профил слабо диференцираних ћелија: SH2 (TGF-(3) рецептор), SH3 (сигнални протеински домен), колаген типова I и III, фибронектин, адхезионски рецептори VCAM-1 (CD106) и ICAM (CD54), кадхерин-11, CD44, CD71 (трансферински рецептор), CD90, CD120a и CD124, али без експресије карактеристичних маркера хематопоетских матичних ћелија (CD34, CD14, CD45). Клонални раст омогућава вишеструко пасирање мезенхималних матичних ћелија са формирањем бројних генетски хомогених стромалних прогениторских плурипотентних ћелија у култури. Након 2-3 пасирања, њихов број достиже 50-300 милиона. У култури довољне густине, након што је пролиферација заустављена, стромалне прогениторске ћелије, за разлику од фибробласта хематопоетског ткива, диференцирају се у адипоците, миоците, хрскавчане и коштане ћелије. Комбинација три регулаторна диференцијациона сигнала, укључујући 1-метил-изобутилксантин (индуктор интрацелуларног формирања цАМП-а), дексаметазон (инхибитор фосфолипаза А и Ц) и индометацин (инхибитор циклооксигеназе, који такође смањује активност тромбоксан синтазе), претвара до 95% прогениторских мезенхималних ћелија у адипоците. Формирање адипоцита из незрелих стромалних елемената потврђује се експресијом гена липопротеин липазе, хистохемијском детекцијом аполипопротеина и пероксизомалних рецептора. Ћелије истог клона под утицајем TGF-b у медијуму без серума стварају хомогену популацију хондроцита. Вишеслојна ћелијска култура овог хрскавчавог ткива карактерише се развијеним међућелијским матриксом који се састоји од протеогликана и колагена типа II. У хранљивој подлози са 10% Дејство комплекса сигнала диференцијације који се састоји од б-глицерофосфата (неоргански донор фосфата), аскорбинске киселине и дексаметазона у истој култури стромалних прогениторских ћелија доводи до формирања ћелијских агрегата. У таквим ћелијама се примећује прогресивно повећање активности алкалне фосфатазе и нивоа остеопонтина, што указује на формирање коштаног ткива, чија је минерализација ћелија потврђена прогресивним повећањем интрацелуларног садржаја калцијума.

Према неким подацима, способност мезенхималних матичних ћелија за неограничену деобу и репродукцију различитих типова ћелија мезенхималне диференцијационе линије комбинована је са високим степеном пластичности. Када се унесу у коморе или белу масу мозга, мезенхималне матичне ћелије мигрирају у паренхим нервног ткива и диференцирају се у деривате глијалне или неуронске ћелијске линије. Поред тога, постоје информације о трансдиференцијацији МСК у хематопоетске матичне ћелије како in vitro тако и in vivo. Детаљнија анализа у неким студијама утврдила је изузетно високу пластичност МСК, која се манифестује у њиховој способности да се диференцирају у астроците, олигодендроците, неуроне, кардиомиоците, ћелије глатких мишића и ћелије скелетних мишића. Низ студија о потенцијалу трансдиференцијације МСК in vitro и in vivo утврдио је да се мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије пореклом из коштане сржи терминално диференцирају у ћелијске линије које формирају коштано, хрскавично, мишићно, нервно и масно ткиво, као и тетиве и строму које подржавају хематопоезу.

Међутим, друге студије нису откриле никакве знаке ограничења плурипотентности генома мезенхималних матичних ћелија и прогениторских популација стромалних ћелија, иако је више од 200 клонова МСК изолованих из једне примарне културе проучавано ради тестирања могуће плурипотентности стромалних ћелија. Огромна већина клонова in vitro задржала је способност диференцијације у остеогеном, хондрогеном и адипогеном правцу. Када се искључи вероватноћа миграције ћелија реципијента трансплантацијом мезенхималних матичних ћелија испод капсуле бубрега или у дифузионим коморама, испоставило се да стромалне прогениторске ћелије in situ задржавају хетерогени фенотип, што указује или на одсуство рестрикционих фактора у зони трансплантације или на одсуство плурипотентности МСК као такве. Истовремено, дозвољено је постојање ретког типа соматских плурипотентних матичних ћелија, које су заједнички прекурсори свих одраслих матичних ћелија.

Мулти-, али не и плурипотентност, правих мезенхималних матичних ћелија, које чине веома мали део ћелија коштане сржи и способне су за пролиферацију под одређеним условима током ин витро култивације без диференцијације, доказује се њиховом индукованом посвећеношћу ћелијама костију, хрскавице, масног ткива, мишићног ткива, као и теноцитима и стромалним елементима који подржавају хематопоезу. По правилу, продужено излагање медијуму за култивацију са феталним телећим серумом изазива ослобађање МСК у посвећене стромалне прогениторске ћелије, чије потомство подлеже спонтаној терминалној диференцијацији. Ин витро је могуће постићи циљано формирање остеобласта додавањем дексаметазона, ß-глицерофосфата и аскорбинске киселине у медијум за кондиционирање, док комбинација дексаметазона и сигнала диференцијације инсулина индукује формирање адипоцита.

Утврђено је да се пре уласка у фазу терминалне диференцијације, МСК коштане сржи првобитно диференцирају у мезенхималне матичне ћелије сличне фибробластима под одређеним условима културе. Деривати ових ћелија in vivo учествују у формирању костију, хрскавице, тетива, масног и мишићног ткива, као и строме која подржава хематопоезу. Многи аутори под термином „мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије“ подразумевају и саме МСК и посвећене стромалне прогениторске ћелије коштане сржи и мезенхималних ткива. Клонска анализа мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија пореклом из коштане сржи показала је да се нешто више од једне трећине свих клонова диференцира у остео-, хондро- и адипоците, док ћелије преосталих клонова имају само остеогени потенцијал и формирају само хондро- и остеоците. Клон мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора као што је BMC-9, под одговарајућим условима микроокружења, диференцира се у ћелије са фенотипом и функционалним карактеристикама не само остеобласта, хондроцита и адипоцита, већ и стромалних ћелија које подржавају хематопоезу. Клон RCJ3.1 ћелија изолованих из коштане сржи фетуса пацова диференцира се у мезенхималне ћелије различитих фенотипова. Под комбинованим дејством аскорбинске киселине, б-глицерофосфата и дексаметазона, ћелијски елементи овог клона прво формирају мултинуклеарне миоците, а затим, секвенцијално, адипоците, хондроците и острвца минерализованог коштаног ткива. Популација грануларних ћелија из периоста фетуса пацова одговара некомитираним мултипотентним мезенхималним ћелијама прогенитора, јер се карактерише ниском стопом пролиферације, не експресује маркере диференцијације и под условима културе диференцира се у хондро-, остео- и адипоците, као и ћелије глатких мишића.

Стога, треба признати да питање плури- или мултипотентности генома мезенхималних матичних ћелија остаје отворено, што, сходно томе, утиче и на идеје о потенцијалу диференцијације стромалних прогениторских ћелија, што такође није дефинитивно утврђено.

Експериментално доказана и важна карактеристика мезенхималних матичних ћелија је њихова способност да напусте ткивну нишу и циркулишу у општем крвотоку. Да би се активирао програм генетске диференцијације, такве циркулишуће матичне ћелије морају ући у одговарајуће микроокружење. Показано је да се систематским уношењем МСК у крвоток животиња прималаца, незреле ћелије имплантирају у различите органе и ткива, а затим се диференцирају у крвне ћелије, миоците, адипоците, хондроците и фибробласте. Сходно томе, у локалним зонама ткива, сигнално-регулаторне интеракције се јављају између некомитираних и комитираних стромалних прогениторских ћелија, као и између њих и околних зрелих ћелија. Претпоставља се да је диференцијација индукована паракриним регулаторним факторима мезенхималног и немезенхималног порекла (фактори раста, еикозаноиди, молекули екстрацелуларног матрикса), који обезбеђују просторне и временске везе у микроокружењу мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија. Стога, локално оштећење мезенхималног ткива требало би да доведе до формирања зона микроокружења мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора које се квалитативно разликују од комплекса регулаторних сигнала интактних ткива, у којима се одвијају физиолошки, а не репаративни процеси регенерације. Ова разлика је изузетно важна у смислу специјализације ћелијског фенотипа у нормалном и оштећењем изазваном микроокружењу.

Према концептима, управо овде су уграђени механизми фундаменталне разлике између два позната процеса - физиолошке регенерације и инфламаторне пролиферације. Први од њих завршава се рестаурацијом специјализованог ћелијског састава ткива и његове функције, док је резултат спровођења процеса пролиферације формирање зрелих елемената везивног ткива и губитак функције оштећене зоне ткива. Стога, за развој оптималних програма за коришћење мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора у регенеративно-пластичној медицини, неопходно је темељно проучавање карактеристика утицаја фактора микроокружења на диференцијацију МСК.

Зависност структуре одељка матичних ћелија од ћелијских пара- и аутокриних регулатора, чија је експресија модулирана спољашњим сигналима, је несумњива. Међу функцијама регулаторних фактора, најважније су контрола асиметричне деобе МСК и експресија гена који одређују фазе обавезивања и број ћелијских деоба. Спољашње сигнале, од којих зависи даљи развој МСК, обезбеђује њихово микроокружење. У незрелом стању, МСК пролиферишу дуго времена, задржавајући способност диференцијације у линије адипоцита, миофибробласта, строму хематогеног ткива, ћелије хрскавице и костију. Утврђено је да се ограничена популација CD34-негативних стромалних ћелијских елемената који циркулишу у крви враћа из општег крвотока у строму коштане сржи, где се трансформише у линије CD34-позитивних хематопоетских матичних ћелија. Ова запажања сугеришу да рециркулација прогениторских мезенхималних ћелија у крвотоку одржава ткивну равнотежу стромалних матичних ћелија у различитим органима мобилизацијом заједничког фонда незрелих стромалних елемената коштане сржи. Диференцијација МСК у ћелије са вишеструким мезенхималним фенотиповима и њихово учешће у регенерацији или поправци костију, хрскавице, масног ткива и тетива in vivo доказана је коришћењем модела адоптивног трансфера код експерименталних животиња. Према другим ауторима, удаљена миграција МСК дуж васкуларног корита комбинована је са кратким или локалним кретањем мултипотентних мезенхималних прогениторских ћелија унутар ткива током поправке хрскавице, регенерације мишића и других ресторативних процеса.

Локалне резерве матичних ћелија базе стромалног ткива делују као извор ћелија у процесима физиолошке регенерације ткива и обнављају се удаљеним транспортом МСК како се троше ресурси матичних ћелија стромалног ткива. Међутим, у условима потребе за хитном мобилизацијом репаративног ћелијског потенцијала, на пример, у случају политравме, цео ешалон МСК учествује у процесима репаративне регенерације, а мезенхималне ћелије прогенитор коштане сржи се регрутују на периферију кроз општи проток крви.

Трансплантација мезенхималних матичних ћелија

Могу се пратити одређене паралеле између процеса физиолошке регенерације ткива и њиховог формирања током интраутериног развоја. У ембриогенези људи и сисара, формирање различитих врста специјализованих ћелија одвија се из екто-, мезо- и ендодермалног базена клициних слојева, али уз обавезно учешће мезенхима. Рахлата ћелијска мрежа ембрионалног мезенхималног ткива обавља бројне регулаторне, метаболичке, оквирне и морфогенетске функције. Полагање провизорних органа се дешава тек након кондензације мезенхима услед клоногеног раста ћелија прогенитора, које генеришу примарне морфогенетске сигнале органогенезе. Стромални деривати ембрионалног мезенхима стварају ћелијски оквир провизорних органа и чине основу за њихово будуће енергетско-пластично снабдевање услед раста примарних крвних и лимфних судова. Другим речима, стромални елементи микроциркулаторне јединице феталних органа настају пре формирања њихових структурних и функционалних јединица. Поред тога, активна миграција мезенхималних ћелија током органогенезе обезбеђује просторну оријентацију органа у развоју обележавањем њихових запреминских граница кроз ограничавање хомеотских Hox-типова. Стромални оквир такође служи као основа за склапање структурних и функционалних јединица паренхиматозних органа, који често укључују морфогенетски и функционално потпуно различите ћелије. Сходно томе, током ембриогенезе, функције мезенхима су примарне и остварују се кроз генерисање регулаторних сигнала који активирају регионалну пролиферацију и диференцијацију прогениторских епителних ћелија. Ембрионалне мезенхимске ћелије производе факторе раста као што су HGF-b, HGF-b, CSF, за које паренхимске прогениторске ћелије имају одговарајуће рецепторе. У диференцираном зрелом ткиву одраслог организма, стромална мрежа ћелија такође генерише сигнале за одржавање виталности и пролиферације прогениторских ћелија немезенхималног порекла. Међутим, спектар стромалних регулаторних сигнала у постнаталној онтогенези је различит (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, итд.) и усмерен је на обезбеђивање физиолошке регенерације или поправке оштећених зона ткива. Штавише, спектралне карактеристике стромалних регулаторних фактора у свакој врсти ткива, па чак и унутар једног органа, су различите. Конкретно, хематопоеза и лимфопоеза са пролиферацијом и диференцијацијом хематопоетских и имунокомпетентних ћелија јављају се само у одређеним органима, унутар чијих граница делује стромално микроокружење, обезбеђујући услове за сазревање хематопоетских и лимфоидних ћелија. Способност хематопоетских и лимфоидних ћелија да поново насељавају дати орган, пролиферишу и сазревају у његовим микроструктурним нишама зависи од регулаторних фактора микроокружења.

Међу компонентама екстрацелуларног матрикса које производе мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије, треба истаћи фибронектин, ламинин, колаген и протеогликане, као и CD44 (хијалуронан и остеопонтински рецептор), који играју главну улогу у организовању међућелијских интеракција и формирању екстрацелуларног матрикса у коштаној сржи и коштаном ткиву. Доказано је да мултипотентне мезенхималне прогениторске ћелије коштане сржи стварају стромално микроокружење које пружа индуктивне и регулаторне сигнале не само МСК, већ и хематопоетским прогениторима и другим немезенхималним матичним ћелијама коштане сржи. Познато је да је учешће МСК у хематопоези одређено њиховом способношћу да се диференцирају у стромалне ћелије које подржавају хематопоезу, а овај инструктивни сигнал МСК примају директно од хематопоетских матичних ћелија. Зато у култури мрежа стромалних прогениторских ћелија служи као хранилица за развој свих клонова хематопоетских ћелија.

У зрелом организму, интензитет хемо- и лимфопоезе је у стању динамичке равнотеже са „трошењем“ зрелих крвних зрнаца и ћелија имуног система на периферији. Пошто се стромалне ћелије коштане сржи и лимфоидних органа обнављају изузетно ретко, значајно реструктурирање стромалних структура у њима се не дешава. Систем може бити изведен из динамичке равнотеже механичким оштећењем било ког од органа хемо- или лимфопоезе, што доводи до једноликих секвенцијалних промена које се тичу не само и не толико хематопоетских или лимфоидних елемената колико стромалних структура оштећеног органа. У процесу репаративне регенерације, прво се формира стромална база, која се затим поново насељава хематопоетским или имунокомпетентним ћелијама. Ова одавно позната чињеница чини посттрауматску регенерацију погодним моделом за проучавање стромалног микроокружења хематопоетских органа. Посебно се механичко пражњење медуларне шупљине цевастих костију користи за проучавање репаративне регенерације коштане сржи - киретаже, која омогућава брзо и ефикасно уклањање хематопоетског ткива из стања динамичке равнотеже. Приликом проучавања процеса репаративне регенерације хематопоетских и стромалних компоненти коштане сржи након механичког пражњења медуларне шупљине тибије заморчића, утврђено је да не постоји директна корелација између индекса регенерације хематопоетских и стромалних ћелија (број хематопоетских ћелија, концентрација и број стромалних прогениторских ћелија). Поред тога, испоставило се да се повећање популације стромалних прогениторских ћелија јавља раније након киретаже, а сами стромални фибробласти постају фосфатаза-позитивни, што је типично за остеогено ткиво. Такође је утврђено да киретажа 3-5 цевастих костију доводи до раста ове ћелијске популације у коштаној сржи неоперисаних костију па чак и у слезини, која је код заморчића искључиво лимфопоетски орган.

Морфолошка слика репаративних процеса у коштаној сржи киретираних тибија замораца углавном одговара подацима описаним у литератури добијеним у експериментима на животињама других врста, а динамика промена које се јављају након уклањања хематопоетског ткива је иста за све животињске врсте и разлика се тиче само временских параметара. Морфолошки, фазни редослед обнове хематопоезе у испражњеној медуларној шупљини састоји се од узастопних процеса организације крвног угрушка, формирања грубог влакнастог коштаног ткива, његове ресорпције, развоја синусоида и формирања ретикуларне строме, која се потом поново насељава хематопоетским елементима. У овом случају, број прогениторских хематопоетских ћелија у процесу регенерације ткива коштане сржи повећава се паралелно са повећањем садржаја хематопоетских матичних ћелија.

Ју. Герасимов и коаутори (2001) упоредили су промене у броју хематопоетских ћелија и броју стромалних прогениторских ћелија у појединачним фазама процеса регенерације. Испоставило се да квантитативне промене у ћелијама коштане сржи у киретираној кости одговарају динамици морфолошких карактеристика регенерације. Аутори повезују смањење ћелијског садржаја у регенерату током прва три дана са смрћу хематопоетских ћелија услед неповољног дејства микроокружења које ствара пролиферирајуће ретикуларно ткиво у очуваној коштаној сржи у региону епифизе, као и са формирањем жаришта остеоидног ткива у овом последњем и васкуларним оштећењем током киретаже. 7-12. дана, повећање нивоа нуклеарних ћелија поклапа се са појавом појединачних жаришта мијелоидне хематопоезе у зонама пролиферације стромалних елемената. 20. дана појављују се значајна подручја регенерисане коштане сржи и добро развијени синуси, што је праћено значајним повећањем укупног броја ћелија. Међутим, број хематопоетских елемената током овог периода је 68% од контролног нивоа. Ово је у складу са раније објављеним подацима да број хематопоетских ћелија након киретаже достиже норму тек 35-40. дана након операције.

У раном посттрауматском периоду, главни извор за обнављање хематопоезе су локални ћелијски елементи сачувани током киретаже. У каснијим фазама, главни извор регенерације хематопоетског ткива коштане сржи су матичне ћелије које репопулирају слободне стромалне зоне. Што се тиче појединачних категорија стромалних ћелија (ендотелних, ретикуларних и остеогених), извори који обезбеђују њихово формирање током реорганизације шупљине коштане сржи остају нејасни. Резултати студије Ју. В. Герасимова и коаутора (2001) указују да је у коштаној сржи сачуваној након киретаже концентрација ћелија које формирају колоније фибробласта знатно већа него у нормалној коштаној сржи. Аутори сматрају да киретажа резултира интензивнијим селективним испирањем хематопоетских ћелија у поређењу са стромалним ћелијама које формирају колоније, а које учествују у формирању строме и јаче су повезане са њеном главном супстанцом него хематопоетске ћелије.

Динамика промене броја ћелија које формирају колоније фибробласта корелира са интензитетом процеса остеогенезе, накнадном ресорпцијом коштаних трабекула и формирањем ретикуларне строме, коју насељавају хематопоетске ћелије. Већина стромалних прогениторских ћелија у наведеним терминима регенерације формира грубо влакнасто коштано ткиво и ретикуларну строму. Код прелома фемура под условима продужене остеосинтезе, 5. дана у зони регенерације концентрација и број ћелија које формирају колоније фибробласта се повећавају, а током периода интензивног формирања костију њихов број се повећава 6 пута. Познато је да ћелије коштане сржи које формирају колоније фибробласта имају остеогена својства. Број стромалних прогениторских ћелија се повећава пре насељавања киретиране територије коштане сржи хематопоетским ћелијама. Ово је у доброј сагласности са подацима да стромалне ћелије обезбеђују формирање хематопоетског микроокружења. Изгледа да стварање хематопоетског микроокружења одговара одређеном нивоу регенерације стромалног ткива, а број хематопоетских ћелија се повећава са ширењем стромалне платформе погодне за хематопоезу.

Од највећег интереса су подаци аутора да се одмах након киретаже повећава број стромалних прогениторских ћелија у удаљеним деловима скелета. Почевши од шестог сата па све до двадесетог дана, у контралатералној тибији се примећује више него двоструко повећање и концентрације и броја ћелија које формирају фибробластне колоније. Механизам овог феномена је вероватно повезан са чињеницом да масивно оштећење коштане сржи доводи до стварања великог броја крвних угрушака уз истовремени уништавање значајног броја тромбоцита и ослобађање фактора раста изведеног из тромбоцита (PDGF) у крв, за који се зна да изазива пролиферацију ћелија које формирају фибробластне колоније које се налазе у телу ван пролиферативног базена. У експериментима на зечевима, локална примена МСК подстиче обнављање хрскавичног ткива хируршки оштећеног коленског зглоба, што може бити повезано са стварањем хондроцита који потичу од убризганих МСК. Међутим, репаративна регенерација коштаних дефеката код лабораторијских пацова је значајно побољшана употребом мезенхималних матичних ћелија затворених у керамички оквир. Стога се може претпоставити да, ако не RBOC, онда неки други фактор који потиче из оштећених стромалних ћелија има удаљени стимулативни ефекат на пролиферацију мезенхималних прогениторских ћелија у интактним зонама коштане сржи и стимулише њихову миграцију у подручје дефекта коштане сржи. Ово је, заузврат, у супротности са подацима из литературе из претходних година који указују да стромалне ћелије одговорне за микроокружење, за разлику од хематопоетских ћелија, нису способне за миграцију и потичу из локалних извора.

Ипак, резултати студије Ју. Герасимова и коаутора (2001) указују на то да механичка траума изазива не само оштро реструктурирање стромалног ткива у киретираној кости, већ и значајне промене у строми у удаљеним интактним костима, тј. да постоји системски одговор стромалног ткива на локалну трауму. Штавише, када се нанесе политравма - вишеструка киретажа - ова реакција је појачана и примећује се не само у оперисаној кости и удаљеним деловима скелета, већ и у лимфоидним органима, посебно у слезини. Механизам таквог системског одговора стромалног ткива коштане сржи и слезине на локалну трауму и политравму остаје непознат. Претпоставља се да је овај процес повезан са деловањем хуморалног фактора који лучи мезенхимална строма медуларне шупљине коштане сржи. Могућност производње од стране стромалних ћелија коштане сржи и слезине органски неспецифичног хуморалног фактора одговорног за пролиферацију ћелија које формирају колоније фибробласта, доказују подаци о њиховој активности стимулације колонија у монослојним културама коштане сржи.

У том смислу, вреди напоменути да се системском применом мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора, њихови деривати репопулирају не само коштана срж, већ и друга ткива, што се користи, посебно, за генску терапију. Показано је да интравенском применом великих количина МСК са геномом дивљег типа мишевима са мутацијом у гену колагена I, донорске ћелије замењују до 30% ћелија у коштаном и хрскавичном ткиву прималаца, а трансфектоване мишје мезенхималне матичне ћелије које луче људски ИЛ-3 ефикасно подржавају хематопоезу током 9 месеци у случају њихове истовремене примене са људским хематопоетским матичним ћелијама имунодефицијентним мишевима.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Генетска модификација мезенхималних матичних ћелија

Међу успесима експерименталне генетске модификације МСК, вреди истаћи трансфекцију гена фактора IX у људске МСК са накнадним преносом трансфектантних ћелија на имунодефицијентне мишеве, што доводи до појаве антихемофилног фактора Б у крви током 8 недеља након трансплантације. У овом експерименту, у трансфектованим ћелијама је спроведена посттранслациона модификација фактора IX помоћу γ-глутамил карбоксилазе. Трансдукција МСК ретровирусним вектором који кодира људски фактор IX била је мање успешна - накнадна примена ових ћелија псу са хемофилијом Б обезбедила је терапеутски ниво фактора IX, одржавајући нормалан интензитет коагулационе хемостазе, само 12 дана.

Трансплантација мезенхималних матичних ћелија у мождани паренхим животиња показала је да се незреле ћелије донора трансформишу и у неуронске и у глијалне популације. Калемљење неуронских деривата здравог мезенхималног ткива донора теоретски омогућава корекцију генетских абнормалности метаболизма мозга код пацијената са Гошеовом болешћу и другим поремећајима метаболизма липида, ганглиозида или угљених хидрата.

Експериментална потрага за условима за трансдиференцијацију стромалних матичних ћелија коштане сржи у ћелије прогениторске за нервно и јетрено ткиво јетре је у току. Пажња истраживача је усмерена на комбинације индуктора диференцијације и специјалних условљених медијума. Конкретно, да би се изоловала примарна култура стромалних ћелија, ћелије коштане сржи испране и ресуспендоване у DMEM/F12 (1/1) медијуму за култивацију са 10% феталног телећег серума се засејавају густином од 200.000/цм2. Након 24 сата, неприлепљене ћелије се уклањају, а ћелије сличне фибробластима причвршћене за пластику се култивишу једну недељу. За диференцијацију ћелија строме коштане сржи у неуробласте користи се кондиционирана подлога добијена тродневном култивацијом примарне културе мишјих ембрионалних фибробласта, као и DMEM/F12 подлога (1/1) са 2% феталног телећег серума и додатком 20 нг/мл НФ или 10-6 М ретиноинске киселине (неуроиндуктори који се користе за неуронску диференцијацију мишјих и људских ембрионалних матичних ћелија). Диференцијација ћелија строме коштане сржи у ћелије прекурсоре хепатоцита индукује се у кондиционираној подлози створеној као резултат тродневне култивације примарне културе мишјих ембрионалних ћелија јетре у DMEM/F12 подлози (1/1) са додатком 10% феталног телећег серума.

Овде треба још једном напоменути да су ћелије строме коштане сржи које формирају колоније хетероморфне и могу се поделити на два типа. Први тип обухвата ћелије сличне фибробластима које формирају филоподије са великим једрима и једним или два нуклеола. Други тип је представљен малим ћелијама вретенастог облика. Приликом култивације ћелија оба типа у условљеном медијуму добијеном на слоју за храњење примарних ембрионалних фибробласта миша, ћелије сличне неуробластима појављују се у култури 3. до 4. дана. У овој фази, оне најчешће имају вретенасти облик са једним или два дуга наставка која се завршавају филоподијама. Ређе су пирамидалне или звездасте ћелије са кратким дендритима. Дендрити неких неуробласта имају карактеристична проширења (пупољке раста) и гране у свом дисталном делу, док други имају изразите конусе раста са филоподијама, кроз које дендрити расту. Сличне морфолошке карактеристике (пупољци и конуси раста са филоподијама) својствене неуробластима који се диференцирају у неуроне детаљно су описане у студијама о неурогенези. На основу овога, неки аутори закључују да су ћелије које су пронашли у култури неуробласти. Конкретно, Е. Шчегелскаја и коаутори (2002) су након култивације примарне културе стромалних ћелија током две недеље у условљеном медијуму који се мењао сваких 3. до 4. дан открили да су се неке од ћелија размножавале док су одржавале недиференцирано стање. Споља, такве ћелије су подсећале на фибробласте и детектоване су у култури заједно са диференцирајућим неуробластима. Већина ћелија (око 80%) била је у различитим фазама диференцијације у ћелије нервног ткива, првенствено у неуроне. Дендритски наставци ових ћелија били су у блиском контакту једни са другима, тако да су ћелије постепено формирале делове нервне мреже на подлози у облику дугих вишећелијских нити. Дендритски наставци неуробласта су постајали знатно дужи, неки од њих су премашили дужину самог тела неурона за 8-10 пута. Удео пирамидалних и звездастих ћелија се постепено повећавао. Дендрити звездастих ћелија су се гранали. Према ауторима, каснија диференцијација пирамидалних и звездастих ћелија у поређењу са вретенастим ћелијама одговара редоследу фаза нормалне неурогенезе код животиња. Као резултат тога, аутори закључују да матичне ћелије строме коштане сржи пролазе кроз индуковану неурогенезу, током које се сва три главна типа неурона формирају из неуробласта in vitro. Прекурсори нервних ћелија су такође откривени током култивације ћелија строме коштане сржи током 3-4 дана у медијуму са 2% феталног серума и 20 нг/мл LIF. Али у овом случају, матичне ћелије су се делиле веома споро, диференцијација неуробласта се догодила само у 30% случајева и нису формирале неуронске мреже. Користећи ретиноичну киселину као један од индуктора диференцијације нервних ћелија, аутори су добили до 25-30% нервних ћелија у култури,са претежно глијалним елементима - астроцитима и олигодендроцитима. Неурони су чинили само трећину свих нервних ћелија, иако су били заступљени са сва три типа: вретенастим, пирамидалним и звездастим ћелијама. Шестог дана култивације стромалних ћелија у медијуму са ретиноичном киселином, нервне ћелије су постале диференцираније, а аксони су пронађени у појединачним пирамидалним неуронима, који се у нормалној неуроонтогенези појављују касније од формирања дендритичних процеса. Према ауторима, упркос ниском приносу нервних ћелија, метод индукције ретиноичном киселином има своје предности: олигодендроцити и астроцити обављају мијелинизирајуће и нутритивне функције током раста дендрита и аксона и неопходни су за нормално формирање нервног ткива. Стога је за поправку његових оштећених подручја in vivo боље користити суспензију неурона обогаћену глијалним ћелијама.

У другој серији експеримената, аутори су покушали да индукују диференцијацију ћелија строме коштане сржи у ћелије јетре. Након три дана култивације матичних ћелија строме коштане сржи у условљеном медијуму добијеном инкубацијом мишјих ембрионалних хепатоцита, пронађене су велике, сферне ћелије, често бинуклеарне, са цитоплазматским инклузијама различитих величина. Ове ћелије су биле у различитим фазама диференцијације и разликовале су се по величини, броју једара и инклузијама у цитоплазми. Гликоген је детектован у већини ових ћелија, на основу чега су их аутори идентификовали као ћелије прекурсоре хепатоцита. Пошто у култури нису пронађене ћелије сличне неуробластима, закључено је да условљени медијум добијен као резултат култивације ембрионалних хепатоцита није имао факторе диференцијације нервних ћелија и, обрнуто, садржао је факторе који индукују диференцијацију ћелија строме коштане сржи у ћелије прекурсоре хепатоцита. У закључку, аутори сугеришу присуство плурипотентности у ћелијама строме коштане сржи, будући да се оне ин витро диференцирају у ћелије нервног или ткива јетре у зависности од специфичног условљеног медијума и коришћених индуктора.

Неке студије су заиста тачно показале диференцијацију стромалних ћелија коштане сржи у кардиомиоците, ћелије хрскавице, коштаног и нервног ткива. Постоје докази да међу ћелијама коштане сржи постоје популације матичних ћелија способних да се диференцирају у хепатоците. У светлу ових података, резултати горе наведених експеримената на мишевима и даље се могу сматрати даљом потврдом присуства у коштаној сржи плурипотентних мезенхималних матичних ћелија способних да се диференцирају у ћелије различитих ткива одраслог организма.

Трансплантација мезенхималних матичних ћелија

У клиничкој трансплантологији, људске мезенхималне матичне ћелије могу се користити за обезбеђивање експанзије хематопоетских матичних ћелија, као и њихових раних прекомитираних потомака. Конкретно, уношење аутологних хематопоетских матичних ћелија и МСК код пацијената оболелих од рака након високих доза хемотерапије убрзава обнављање броја неутрофила и тромбоцита у периферној крви. Ало- и аутологне трансплантације мезенхималних матичних ћелија користе се за лечење мултиплог мијелома, апластичне анемије и спонтане тромбоцитопеније - болести повезаних са примарним дефектом у строми хематопоетског ткива. Ефикасност ћелијске терапије у онкохематолошкој патологији је у многим случајевима већа уз истовремену уношење стромалних и хематопоетских матичних ћелија, што се манифестује смањењем постоперативног периода обнављања хематопоезе, смањењем броја смртних исхода услед неселективног уништавања регионалних и циркулишућих ћелија рака, при чему умиру и сопствене прогениторске хематопоетске ћелије пацијента. Перспективе коришћења МСК и других мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора у клиничкој пракси су због релативне лакоће њиховог добијања из аспираната коштане сржи, експанзије у култури и трансфекције терапијских гена. Истовремено, локална имплантација мултипотентних мезенхималних ћелија прогенитора може се користити за компензацију локалних ткивних дефеката, а у случају системских дисфункција ткива мезенхималног порекла, није искључено њихово уношење у општи крвоток.

Аутори радова, у којима се анализирају перспективе употребе МСК за локалну, системску трансплантацију и генску терапију са становишта биологије стромалних ћелија, опрезнији су у свом размишљању. Постнатална коштана срж се традиционално сматра органом који се састоји од два главна система јасно дефинисаних ћелијских линија - самог хематопоетског ткива и потпорне строме повезане са њим. Стога су мезенхималне матичне ћелије коштане сржи у почетку сматране искључиво извором стромалне основе за производњу регулаторних фактора хематопоетског микроокружења. Затим се пажња истраживача пребацила на проучавање улоге МСК као матичних извора скелетних ткива. Најновији подаци указују на неочекивани потенцијал за диференцијацију стромалних ћелија коштане сржи са формирањем нервног или мишићног ткива. Другим речима, мезенхималне матичне ћелије показују трансгермалну пластичност - способност да се диференцирају у типове ћелија фенотипски неповезане са ћелијама оригиналног ткива. Истовремено, неки аспекти биологије стромалних ћелија коштане сржи остају нејасни и нерешени како у општебиолошком смислу, тако и у појединачним детаљима, укључујући идентификацију, природу, порекло, развој и функцију стромалних ћелија коштане сржи in vivo, као и дозвољени потенцијал диференцијације ex vivo и могућности терапијске употребе in vivo. Подаци добијени о потенцијалу МСК, као и резултати студија регенеративног потенцијала других матичних ћелија, у оштрој су супротности са догмама утврђеним у биологији.

Када се култивишу при ниској густини, матичне ћелије строме коштане сржи формирају различите колоније, од којих свака потиче из једне прогениторске ћелије. Проценат стромалних прогениторских ћелија у ћелијама коштане сржи са нуклеусом, одређен способношћу формирања колонија, у великој мери зависи и од услова културе и од врсте МСК. На пример, код глодара, присуство озрачених ћелија хранилица коштане сржи и серума у култури је апсолутно неопходно да би се добио максималан број стромалних прогениторских ћелија, док је код људи ефикасност формирања колонија мезенхималних матичних ћелија независна и од хранилице и од подлоге за култивацију. Број познатих митогених фактора који стимулишу пролиферацију стромалних прогениторских ћелија је ограничен. То укључује PDGF, EGF, FGF, TGF-b и IGF1. Под оптималним условима културе, поликлоналне МСК линије могу да издрже више од 50 ћелијских деоба in vitro, што омогућава добијање милијарди стромалних ћелија коштане сржи из 1 мл њеног аспирата.

Међутим, популација стромалних ћелија коштане сржи је хетерогена, што се манифестује како варијабилношћу у величинама колонија, различитим брзинама њиховог формирања, тако и разноврсном ћелијском морфологијом, која покрива распон од вретенастих ћелија сличних фибробластима до великих равних ћелија. Током развоја таквих култура, фенотипска хетерогеност се такође примећује након 20 дана. Неке колоније карактерише висока експресија алкалне фосфатазе, друге је уопште не експресују, а колоније трећег типа су фосфатаза-позитивне у централном региону и фосфатаза-негативне на периферији. Појединачне колоније формирају нодуле коштаног ткива (почетак минерализације матрикса обележен је бојењем ализарин црвеном бојом или за калцијум према Ван Косу). У другим колонијама долази до акумулације масти, што се идентификује Г-бојењем уљном црвеном бојом. Ређе, колоније мезенхималних матичних ћелија формирају хрскавице обојене алцијан плавом бојом).

Након ектопичне трансплантације у експерименталне животиње, поликлоналне МГК линије формирају ектопичну кост са ретикуларном стромом повезаном са мијелопоезом и адипоцитима, а ређе и са хрскавичним ткивом. Када се трансплантирају моноклонске линије стромалних ћелија коштане сржи, у неким случајевима се примећује химеризам, у коме се de novo кост састоји од ћелија коштаног ткива, садржи строму и адипоците донорског порекла, док ћелије хематопоетске лозе и васкуларног система потичу од примаоца.

Резултати ових студија потврђују матичну природу ћелија прогенитора строме коштане сржи из којих је изведена клонска линија. Они такође указују на то да нису све ћелије клоногене у култури заиста мултипотентне матичне ћелије. Неки истраживачи верују, а ми делимо њихово мишљење, да се најпоузданије информације о стварном потенцијалу диференцијације појединачних клонова могу добити само in vivo након трансплантације, а не одређивањем фенотипа њихових деривата in vitro. Експресија у култури фенотипских маркера остео-, хондро- или адипогенезе (одређених mRNA или хистохемијским техникама), па чак ни производња минерализованог матрикса, не одражавају степен плурипотентности појединачног клона in vivo. Стога је идентификација матичних ћелија у групи стромалних ћелија могућа само a posteriori, под одговарајућим условима биолошког трансплантационог теста. Посебно, хондрогенеза се веома ретко примећује у отвореним системима трансплантације, док је формирање хрскавице далеко од неуобичајеног у затвореним системима као што су дифузионе коморе или in vitro микромасене културе стромалних ћелија, где се постиже локални низак притисак кисеоника, што подстиче формирање хрскавичног ткива. Стога, чак и техника трансплантације, као и неспецифични услови културе in vitro, значајно утичу на опсег диференцијације MSC.

Експериментална трансплантација под одређеним експерименталним условима је златни стандард за одређивање потенцијала диференцијације стромалних ћелија коштане сржи и кључни елемент у њиховој идентификацији. Историјски гледано, студије о трансплантацији стромалних ћелија коштане сржи повезане су са општим проблемом трансплантације коштане сржи. Утврђено је да се хематопоетско микроокружење ствара трансплантацијом ћелијских линија стромалних ћелија коштане сржи и да обезбеђује ектопични развој хематопоетског ткива у зони трансплантације. Порекло микроокружења од донора и хематопоетског ткива од домаћина омогућава нам да ектопично коштање сматрамо правом „инвертованом“ трансплантацијом коштане сржи. Локална трансплантација стромалних ћелија коштане сржи промовише ефикасну корекцију коштаних дефеката, израженију него код спонтане репаративне регенерације. Неколико преклиничких студија на експерименталним моделима убедљиво је показало могућност коришћења трансплантација стромалних ћелија коштане сржи у ортопедији, иако је потребан најпажљивији рад и анализа да би се оптимизовале ове методе, чак и у најједноставнијим случајевима. Посебно, оптимални услови за ширење остеогених стромалних ћелија ex vivo још увек нису успостављени, структура и састав идеалног носача, као и број ћелија неопходних за волуметријску регенерацију костију, остају неразвијени.

Поред употребе ex vivo проширених стромалних ћелија коштане сржи за регенерацију ткива мезенхималног порекла, неортодоксна пластичност МСК отвара потенцијалне примене за регенерацију нервних ћелија или испоруку генских производа у ЦНС. У принципу, ово поједностављује ћелијску терапију за оштећење нервног система, јер нема потребе за добијањем аутологних људских нервних матичних ћелија. Пријављене су потенцијалне примене ћелија коштане сржи за стварање кардиомиоцита и миогених прогениторских ћелија, како правог стромалног, тако и екстрастромалног порекла.

Спроводе се експерименти системске трансплантације стромалних ћелија коштане сржи за лечење уобичајених скелетних болести. Нема сумње да су стромалне ћелије коштане сржи популација одговорна за генетске поремећаје код скелетних болести, што је добро илустровано векторским преносом генетских информација помоћу ових ћелија, што доводи до формирања патолошког коштаног ткива код експерименталних животиња. Међутим, способност стромалних ћелија да се имплантирају, калеме, пролиферишу и диференцирају у скелетним костима након уношења у општи крвоток још није доказана.

Делимично је то зато што се код стандардне трансплантације коштане сржи строма не трансплантира заједно са хематопоетским ткивом, тако да строги критеријуми за процену успешног прихватања системски примењених стромалних ћелија још увек нису развијени. Треба имати на уму да присуство маркер гена у екстрактима ткива или изолација ћелија донорског порекла у култури не указује на прихватање ћелија, већ само на њихово преживљавање. Чак и интраартеријска ињекција стромалних ћелија коштане сржи у мишји уд може довести до практично нултог прихватања, упркос чињеници да се ћелије донорског порекла налазе у великом броју унутар микроваскулатуре коштане сржи. Нажалост, такве ћелије се обично описују као „прихваћене“ једноставно на основу детекције маркер гена за донорске ћелије у ex vivo култури. Поред тога, морају се пружити убедљиви докази о дугорочној интеграцији диференцираних и функционално активних ћелија донорског порекла у ткивима која се испитују. У многим објављеним радовима који извештавају о прихватању стромалних ћелија коштане сржи у скелет, одсуство јасних података ове врсте је упечатљиво. Међутим, треба напоменути да су неки исправни експерименти на животињама заиста утврдили ограничено, али стварно прихватање стромалних прогениторских ћелија након њихове системске примене.

Ови подаци су у складу са резултатима студија о могућности испоруке миогених ћелија прогенитора коштане сржи у мишић путем васкуларног система. Међутим, не треба заборавити да се и скелетно и мишићно ткиво формирају током развоја и раста на основу екстраваскуларних кретања ћелија које користе процесе миграције који не укључују циркулацију крви. Ако постоји независан циркулаторни пут за испоруку ћелија прогенитора у ткива чврсте фазе, да ли је могуће претпоставити постојање физиолошки циркулишућих мезенхималних ћелија прогенитора? Какво је порекло ових ћелија и у организму у развоју и у постнаталном периоду и како оне продиру кроз васкуларни зид? Решење ових питања делује апсолутно неопходно и захтева најпажљивију преклиничку анализу. Чак и након што се пронађу одговори на ова питања, проблематични кинетички аспекти повезани са растом скелета и ремоделирањем везивног ткива остаће нерешени. Истовремено, лечење поремећаја остеогенезе заменом целе популације мутираних ћелија скелета прогенитора здравим стромалним елементима изгледа као реална клиничка перспектива. У овом случају, локалне зоне прелома или деформације услед патолошке остеогенезе, као и деструктивне промене у коштаном ткиву, могу се кориговати коришћењем стромалних матичних ћелија култивисаних in vitro. Стога је препоручљиво усмерити будућа истраживања на проблеме трансформације или генетске корекције аутологних мутираних остеогених ћелија прогенитора ex vivo.

Генетски инжењеринг ћелија, краткорочни или трајни, постао је основа ћелијске и молекуларне биологије, извор многих научних открића која се тичу улоге појединачних протеина у ћелијском метаболизму in vitro и in vivo. Употреба молекуларних технологија за корекцију наследне патологије и људских болести је веома перспективна за практичну медицину, јер својства стромалних матичних ћелија коштане сржи омогућавају развој јединствених шема трансплантације за корекцију генетских болести скелета. Истовремено, мезенхималне прекурсорске ћелије се лако могу добити од будућег примаоца, подложне су генетској манипулацији и способне су да се умножавају у великим количинама у кратком временском периоду. Употреба мезенхималних матичних ћелија омогућава да се избегну ограничења и ризици повезани са испоруком генетског информационог материјала директно пацијенту путем интраваскуларних векторских конструкција. Слична стратегија је применљива и на ембрионалне матичне ћелије, али су аутологне постнаталне стромалне ћелије коштане сржи пожељнији материјал, јер њихово уношење искључује могуће имунолошке компликације након трансплантације. Да би се постигао краткорочни ефекат, на пример, за убрзање регенерације костију, најоптималнија метода је генетска модификација мезенхималних матичних ћелија коришћењем електропорације, хемијске фузије, липофекције, плазмида и аденовирусних конструкција. Конкретно, вирусна трансфекција у ћелије строме коштане сржи BMP-2 показала се ефикасном у убрзавању регенерације костију код експерименталне политравме. Стварање аденовирусних векторских конструкција је пожељније због одсуства токсичности. Међутим, генетска модификација ћелија строме коштане сржи у овом случају карактерише се изузетно ниском стабилношћу. Поред тога, нормално трансформисане ћелије строме коштане сржи захтевају употребу векторских носилаца генетских информација који су 10 пута заразнији од других типова ћелија, што значајно повећава проценат смрти трансфектованих ћелија.

Лечење рецесивних болести узрокованих ниском или нултом биолошком активношћу одређених гена захтева дугорочну или трајну модификацију мезенхималних матичних ћелија, што захтева употребу адено-асоцираних вируса, ретровируса, лентивируса или адено-ретровирусних химера. Транспортни региони ових вируса су способни за пренос великих ДНК трансфеката (до 8 kb). У научној литератури је већ објављена егзогена биолошка активност стромалних ћелија коштане сржи трансфектованих ретровирусним конструкцијама које кодирају синтезу регулаторних и маркерских молекула - IL-3, CD2, фактора VIII, као и ензима укључених у синтезу L-DOPA. Међутим, чак и у овим студијама, аутори указују на низ ограничења која треба превазићи пре практичне примене ове технологије. Први проблем је оптимизација процеса модификације MSC ex vivo. Познато је да дугорочна (3-4 недеље) пролиферација стромалних ћелија коштане сржи in vitro смањује њихову трансфекцију. Истовремено, да би се постигао висок ниво генетске модификације MSC, потребно је спровести неколико циклуса трансфекције. Други проблем је повезан са трајањем терапијске експресије гена, које још увек не прелази четири месеца. Природно смањење ефективне експресије гена последица је инактивације промотора и смрти модификованих ћелија. Са општим изгледима преноса генетских информација коришћењем мезенхималних матичних ћелија, резултати прелиминарних студија указују на потребу за даљом оптимизацијом метода ex vivo трансфекције, избором адекватног промотора који регулише биолошку активност у жељеном смеру и повећањем способности модификованих ћелија строме коштане сржи за самоодржавање in vivo након трансплантације. Треба напоменути да употреба ретровирусних конструкција за модификацију ћелија строме коштане сржи у жељеном смеру не захтева увек њихово обавезно калемљење. Трансфектоване мезенхималне матичне ћелије могу обављати корективну функцију на позадини стабилног боравка и без обавезног активног физичког уграђивања и функционисања у везивном ткиву. У овом случају, треба их сматрати биолошком мини-пумпом која in vivo производи фактор чији недостатак одређује манифестацију генетске патологије.

Употреба трансформисаних ћелија строме коштане сржи за лечење доминантне генетске патологије, коју карактерише експресија гена са патолошком или абнормалном биолошком активношћу, много је проблематичнија, јер је у овом случају потребно блокирати пренос или имплементацију искривљених генетских информација. Једна од метода генетског инжењеринга је хомологна рекомбинација ембрионалних матичних ћелија како би се створиле трансгене животиње. Међутим, изузетно низак степен хомологне рекомбинације у комбинацији са проблемима идентификације, раздвајања и ширења таквих рекомбинанта вероватно неће допринети широкој употреби ове методе у блиској будућности, чак и ако се развију нове технолошке методе. Други приступ у генској терапији доминантне патологије заснива се на аутоматској корекцији оштећене ДНК, пошто се генетске мутације могу кориговати уношењем егзогене ДНК са жељеном секвенцом (кратки ДНК олигонуклеотиди или химерни РНК/ДНК олигонуклеотиди), која се везује за хомологе у оштећеном геному. Трећа опција подразумева блокирање преноса патолошких информација, што се постиже употребом посебно дизајнираних олигонуклеотида који се везују за одређени ген и формирају тернарну хеликалну структуру која елиминише могућност транскрипције.

Иако корекција генетске болести на нивоу генома остаје најоптималнија и најпожељнија терапијска метода, иРНК је такође обећавајући вектор (могуће чак и приступачнији) за блокирање доминантно негативног гена. Молекули протеина са антисенс олигонуклеотидом или комплетним секвенцама које блокирају везивање иРНК за ћелијски биосинтетски апарат одавно се користе за инхибицију транслације и/или повећање деградације иРНК. Поред тога, дволанчана РНК индукује брзу деградацију иРНК, чији механизам остаје нејасан. Међутим, мало је вероватно да ће сама елиминација иРНК транскрибованих из мутантног алела са кратким или једним мутацијама промовисати експресију иРНК нормалног алела. Алтернатива је употреба рибосинтеза типа „чекић“ и „укосница“, које имају способност да се вежу за високо специфичне регионе иРНК са накнадном индукцијом њиховог цепања и инактивације током транслације. Могућност коришћења ове методе у терапији патолошке остеогенезе се тренутно проучава. Без обзира на то шта је тачно циљ - геномски или цитоплазматски елементи, успех нових технологија генске терапије биће одређен ефикасношћу укључивања реагенса у ћелије строме коштане сржи ex vivo, оптималним избором специфичног вектора и стабилном способношћу мезенхималних матичних ћелија да експресују потребне факторе in vivo.

Дакле, откриће мезенхималних матичних ћелија са њиховим неочекиваним својствима ствара нову концептуалну шему за развој ћелијских линија. Међутим, потребна су даља интердисциплинарна истраживања како би се разумела биолошка улога стромалних матичних ћелија, њихова природа, њихова способност трансдиференцијације или дедиференцијације, њихов физиолошки значај током ембрионалног развоја, постнаталног раста, сазревања и старења, као и код људских болести.