Матичне ћелије и регенеративна и пластична медицина

Данас је мало лекара у пракси који не знају за развој новог правца у лечењу најтежих болести, раније неизлечивих традиционалном и алтернативном медицином. Говоримо о регенеративно-пластичној медицини, заснованој на коришћењу регенеративног потенцијала матичних ћелија. Око развојног правца настала је невиђена научна дискусија и псеудонаучна помпа, у великој мери настала захваљујући информативним хиперболама интернета. За веома кратко време, лабораторијске студије терапеутских могућности матичних ћелија превазишле су експеримент и почеле су активно да се уводе у практичну медицину, што је довело до мноштва проблема научне, етичке, верске, правне и законодавне природе. Државне и јавне институције су се очигледно показале неспремним за брзину преласка матичних ћелија из Петријевих шоља у системе за интравенозну примену, што није корисно ни за друштво у целини ни за конкретну патећу особу. Није лако разумети незамисливу количину информација о могућностима матичних ћелија, како у количини тако и у квалитету, чак ни за специјалисте (којих нема, пошто сви покушавају сами да савладају нови научни тренд), а да не помињемо лекаре који нису директно укључени у регенеративну пластичну медицину.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Зашто су такви експерименти потребни и да ли су уопште потребни?

На први поглед, стварање ћелијских интерспецијских химера је плод необуздане фантазије фанатичног научника који је заборавио на биоетику. Међутим, управо је овај приступ значајно проширио наша фундаментална знања о ембриогенези, јер је омогућио израчунавање броја ћелија неопходних за органогенезу (формирање јетре, мозга, коже и органа имуног система). Поред тога (можда је то главна ствар у биологији ЕСЦ), генетичари су добили јединствени алат на располагање, помоћу којег се може утврдити функционална сврха гена током химеризације ембриона. Прво, користи се посебна техника двоструког нокаута да би се „искључио“ проучавани пар гена у ЕСЦ. Затим се такве ЕСЦ уносе у бластоцисту и прате се промене које се дешавају у телу химерног ембриона у развоју. На овај начин су утврђене функције гена sf-1 (развој надбубрежне жлезде и гениталних органа), urt-l (зачепљење бубрега), muoD (развој скелетних мишића), gata-l-4 (зачепљење еритропоезе и лимфопоезе). Поред тога, људски гени који још нису проучавани могу се унети (трансфектовати) у ембрионалне ћелије (ЕСЦ) лабораторијских животиња како би се утврдила њихова функција коришћењем химерног ембриона.

Али, по правилу, оправдавање експеримента добијањем нових фундаменталних знања не наилази на подршку широке публике. Наведимо пример примењеног значаја химеризације помоћу ЕСЦ. Пре свега, ово је ксенотрансплантација, односно трансплантација животињских органа људима. Теоретски, стварање химера људско-свињских ћелија омогућава нам да добијемо животињу која је по антигенским карактеристикама много ближа донору ЕСЦ, што у различитим клиничким ситуацијама (дијабетес мелитус, цироза јетре) може спасити живот болесној особи. Истина, за ово прво морамо научити како да вратимо својство тотипотентности геному зреле соматске ћелије, након чега се она може унети у ембрион свиње у развоју.

Данас се способност ЕСЦ-а да се деле готово бесконачно под посебним условима култивације користи за производњу тотипотентне ћелијске масе са њеном накнадном диференцијацијом у специјализоване ћелије, као што су допаминергички неурони, који се затим трансплантирају пацијенту са Паркинсоновом болешћу. У овом случају, трансплантацији нужно претходи циљана диференцијација добијене ћелијске масе у специјализоване ћелије потребне за третман и пречишћавање потоњих од недиференцираних ћелијских елемената.

Како се касније испоставило, претња канцерогенезе није била једина препрека трансплантацији ћелија. Спонтано, ембрионалне ћелијске ћелије (ЕСЦ) у ембриоидним телима се хетерогено диференцирају, односно формирају деривате широког спектра ћелијских линија (неурони, кератиноцити, фибробласти, ендотелиоцити). У видном пољу микроскопа у овом случају, кардиомиоцити се истичу међу ћелијама различитих фенотипова, од којих се сваки контрахује у свом ритму. Међутим, за лечење пацијента неопходно је имати чисте ћелијске популације: неуроне - у случају можданог удара, кардиомиоците - у случају инфаркта миокарда, β-ћелије панкреаса - у случају дијабетес мелитуса, кератиноците - у случају опекотина итд.

Следећа фаза у развоју ћелијске трансплантологије била је повезана са развојем технологија за добијање довољног броја (милиона ћелија) таквих чистих ћелијских популација. Потрага за факторима који узрокују усмерену диференцијацију ЕСЦ била је емпиријске природе, јер је редослед њихове синтезе током ембриогенезе остао непознат. У почетку је утврђено да се формирање жуманчане кесе индукује додавањем цАМП-а и ретиноинске киселине у културу ЕСЦ. Хематопоетске ћелијске линије су формиране у присуству 1L-3, SCF-а, фактора раста фибробласта (FGH), инсулину сличног фактора раста (IGF-1), 1L-6 и фактора стимулације колонија гранулоцита (G-СSF) у медијуму за култивацију. Ћелије нервног система су формиране из ЕСЦ након уклањања LIF-а и слоја фибробласта, који је служио као хранилица. Након третмана ретиноичном киселином у присуству феталног серума, ЕСЦ су почеле да се диференцирају у неуроне, а кардиомиоцити су добијени додавањем диметил сулфоксида (DMSO), који обезбеђује циљану испоруку хидрофобних сигналних молекула у ћелијско једро. У овом случају, акумулација активних врста кисеоника у медијуму за култивацију, као и електрична стимулација, допринели су формирању зрелих контрактилних кардиомиоцита.

Огромни напори и ресурси су утрошени на проналажење услова за диференцијацију ЕСЦ у ћелије панкреаса које производе инсулин. Међутим, убрзо је постало јасно да се бројне специјализоване ћелијске линије (β-ћелије панкреаса, имуне и ендокрине ћелије, адипоцити) не развијају из ЕСЦ када се стимулишу по принципу „један стимулишући фактор - једна ћелијска линија“. Овај принцип се показао важећим само за ограничен број ћелијских линија. Конкретно, формирање неурона може се индуковати ретиноичном киселином, мишићном ћелијском линијом - трансформишућим фактором раста-β (TCP-β), еритроидним линијама - 1L-6, моноцитно-мијелоидном линијом - 1L-3. Штавише, ефекти ових фактора на диференцијацију ЕСЦ су се показали строго зависним од дозе.

Почела је фаза тражења комбинација фактора раста које би унапредиле ембрионалне ћелије (ЕСЦ) у касније фазе ембриогенезе са формирањем мезодерма (извор кардиомиоцита, скелетних мишића, епитела бубрежних тубула, мијелоеритропоезе и глатких мишићних ћелија), ектодерма (епидермис, неурони, мрежњача) и ендодерма (епител танког црева и секреторних жлезда, пнеумоцити). Природа је као да је приморала истраживаче да се крећу напред путем ембриогенезе, понављајући њене фазе у Петријевој шољи, не дајући прилику да одмах и лако добију жељени резултат. И такве комбинације фактора раста су пронађене. Активин А у комбинацији са TGF-β показао се као моћан стимулатор формирања мезодермалних ћелија из ЕСЦ, док блокира развој ендодерма и ектодерма. Ретиноинска киселина и комбинација сигнала морфогенетског протеина коштане сржи (BMP-4) и епидермалног фактора раста (EGF) активирају формирање екто- и мезодермалних ћелија, заустављајући развој ендодерма. Интензиван раст ћелија сва три клицина слоја се примећује уз истовремени ефекат два фактора на ембрионалне ћелије (ЕСЦ) - фактора раста хепатоцита (ХГФ) и фактора раста нервних ћелија.

Дакле, да би се добиле потребне ћелијске линије, потребно је прво пренети ембрионалне матичне ћелије до фазе формирања ћелија неког клициног слоја, а затим одабрати нову комбинацију фактора раста способних да индукују усмерену диференцијацију екто-, мезо- и ендодерма у специјализоване ћелије неопходне за трансплантацију пацијенту. Број комбинација фактора раста данас је у хиљадама, већина њих је патентирана, неке биотехнолошке компаније уопште не откривају.

Било је време да се добијене ћелије пречисте од недиференцираних ћелијских нечистоћа. Ћелије диференциране у култури су обележене маркерима зрелих ћелијских линија и пропуштене кроз брзи ласерски имунофенотипски сортер. Ласерски сноп их је пронашао у општем ћелијском току и усмерио их дуж засебне путање. Лабораторијске животиње су прве добиле добијени пречишћени ћелијски материјал. Било је време да се процени ефикасност коришћења ЕСЦ деривата на моделима болести и патолошких процеса. Један од таквих модела била је експериментална Паркинсонова болест, која се добро репродукује код животиња коришћењем хемијских једињења која уништавају допаминергичке неуроне. Пошто се болест код људи заснива на стеченом недостатку допаминергичких неурона, употреба терапије заменом ћелија у овом случају била је патогенетски оправдана. Код животиња са експерименталним хемипаркинсонизмом, око половина допаминергичких неурона добијених из ЕСЦ и унетих у мождане структуре се примила. То је било довољно да значајно смањи клиничке манифестације болести. Покушаји да се обнови функција оштећених структура ЦНС-а код експерименталних можданих удара, повреда, па чак и руптура кичмене мождине показали су се прилично успешним.

Међутим, треба напоменути да су скоро сви случајеви успешне употребе диференцираних ЕСК деривата за корекцију експерименталне патологије предузети у акутном периоду симулиране патолошке ситуације. Резултати удаљеног лечења нису били толико утешни: након 8-16 месеци, позитиван ефекат трансплантације ћелија је нестао или се нагло смањио. Разлози за то су сасвим јасни. Диференцијација трансплантираних ћелија in vitro или in loco morbi неизбежно доводи до експресије ћелијских маркера генетске страности, што изазива имунолошки напад организма примаоца. Да би се решио проблем имунолошке некомпатибилности, коришћена је традиционална имуносупресија, паралелно са којом су клиничка испитивања почела да схватају потенцијал трансдиференцијације и генетске корекције аутологних хематопоетских и мезенхималних матичних ћелија које не изазивају имунолошки конфликт.

Шта је регенеративна пластична медицина?

Еволуција је одредила две главне опције за крај живота ћелије - некрозу и апоптозу, које на нивоу ткива одговарају процесима пролиферације и регенерације. Пролиферација се може сматрати врстом жртвовања, када се попуњавање дефекта оштећеног ткива дешава због његове замене елементима везивног ткива: уз очување структурног интегритета, тело делимично губи функцију погођеног органа, што одређује накнадни развој компензаторних реакција са хипертрофијом или хиперплазијом структурних и функционалних елемената који остају нетакнути. Трајање периода компензације зависи од обима структурних лезија изазваних факторима примарне и секундарне алтерације, након чега, у великој већини случајева, долази до декомпензације, наглог погоршања квалитета и смањења трајања људског живота. Физиолошка регенерација обезбеђује процесе ремоделирања, односно замену старећих и умирућих ћелија механизмима природне ћелијске смрти (апоптозе) новим које потичу из резерви матичних ћелија људског тела. Процеси репаративне регенерације такође укључују ћелијске ресурсе матичних простора, који се, међутим, мобилишу под патолошким условима повезаним са болешћу или оштећењем ткива, покрећући ћелијску смрт кроз механизме некрозе.

Пажња научника, лекара, штампе, телевизије и јавности на проблем проучавања биологије ембрионалних матичних ћелија (ЕМЋ) последица је, пре свега, високог потенцијала ћелијске или, како је називамо, регенеративно-пластичне терапије. Развој метода за лечење најтежих људских болести (дегенеративна патологија централног нервног система, повреде кичмене мождине и мозга, Алцхајмерова и Паркинсонова болест, мултипла склероза, инфаркт миокарда, артеријска хипертензија, дијабетес мелитус, аутоимуне болести и леукемија, опекотине и неопластични процеси чине далеко од потпуне листе) заснива се на јединственим својствима матичних ћелија, које омогућавају стварање нових ткива која замењују, како се раније веровало, неповратно оштећене области ткива оболелог организма.

Напредак теоријских истраживања биологије матичних ћелија током протеклих 10 година остварен је спонтано настајућим областима регенеративно-пластичне медицине у настајању, чија методологија није само прилично подложна систематизацији, већ је и захтева. Прва и најбрже развијајућа област практичне употребе регенеративног потенцијала матичних ћелија постала је заменска регенеративно-пластична терапија. Њен пут се прилично лако прати у научној литератури - од експеримената на животињама са некрозом миокарда до радова последњих година усмерених на обнављање постинфарктног дефицита кардиомиоцита или надокнађивање губитка β-ћелија панкреаса и допаминергичких неурона централног нервног система.

Трансплантација ћелија

Основа супститутивне регенеративно-пластичне медицине је трансплантација ћелија. Потоњу треба дефинисати као комплекс медицинских мера, током којих тело пацијента има директан контакт са одрживим ћелијама ауто-, ало-, изо- или ксеногеног порекла током кратког или дужег временског периода. Средство трансплантације ћелија је суспензија матичних ћелија или њихових деривата, стандардизована бројем трансплантационих јединица. Трансплантациона јединица је однос броја јединица које формирају колоније у култури према укупном броју трансплантираних ћелија. Методе трансплантације ћелија: интравенозна, интраперитонеална, поткожна примена суспензије матичних ћелија или њихових деривата; примена суспензије матичних ћелија или њихових деривата у коморе мозга, лимфне судове или цереброспиналну течност.

Ало- и аутологна ћелијска трансплантација користе два фундаментално различита методолошка приступа реализацији плури-, мулти- или полипотентног потенцијала матичних ћелија - in vivo или in vitro. У првом случају, уношење матичних ћелија у тело пацијента се врши без њихове претходне диференцијације, у другом - након размножавања у култури, циљане диференцијације и пречишћавања од недиференцираних елемената. Међу бројним методолошким техникама ћелијске терапије заменом, сасвим јасно се разликују три групе метода: замена коштане сржи и крвних ћелија, замена ћелија органа и меких ткива, замена крутих и чврстих елемената тела (хрскавица, кости, тетиве, срчани залисци и капацитивни судови). Потоњи правац треба дефинисати као реконструктивну и регенеративну медицину, будући да се потенцијал диференцијације матичних ћелија реализује на матрици - биолошки инертној или апсорбујућој структури обликованој као замењени део тела.

Још један начин повећања интензитета регенеративно-пластичних процеса у оштећеним ткивима је мобилизација сопствених матичних ресурса пацијента коришћењем егзогених фактора раста, као што су фактори стимулације колонија гранулоцита и гранулоцита-макрофага. У овом случају, руптура стромалних веза доводи до повећања ослобађања хематопоетских матичних ћелија у општи крвоток, које у подручју оштећења ткива обезбеђују процесе регенерације због своје инхерентне пластичности.

Дакле, методе регенеративне медицине усмерене су на стимулисање процеса обнављања изгубљене функције - било кроз мобилизацију сопствених матичних резерви пацијента, било увођењем алогеног ћелијског материјала.

Важан практични резултат открића ембрионалних матичних ћелија јесте терапијско клонирање засновано на разумевању окидача ембриогенезе. Ако је почетни сигнал за почетак ембриогенезе пре-мРНК комплекс који се налази у цитоплазми ооцита, онда би уношење једра било које соматске ћелије у енуклеирану јајну ћелију требало да покрене програм развоја ембриона. Данас већ знамо да око 15.000 гена учествује у спровођењу програма ембриогенезе. Шта се са њима дешава касније, након рођења, током периода раста, зрелости и старења? Одговор на ово питање дала је овца Доли: они су очувани. Користећи најсавременије методе истраживања, доказано је да једра одраслих ћелија задржавају све кодове неопходне за формирање ембрионалних матичних ћелија, клициних листова, органогенезу и рестрикционо сазревање (излазак у диференцијацију и специјализацију) ћелијских линија мезенхималног, екто-, ендо- и мезодермалног порекла. Терапеутско клонирање као правац формирано је већ у најранијим фазама развоја ћелијске трансплантологије и предвиђа враћање тотипотентности сопственим соматским ћелијама пацијента ради добијања генетски идентичног материјала за трансплантацију.

Откриће матичних ћелија почело је „од краја“, јер се термин који је у биологију и медицину увео А. Максимов односио на матичне ћелије коштане сржи, које дају порекло свим зрелим ћелијским елементима периферне крви. Међутим, хематопоетске матичне ћелије, као и ћелије свих ткива одраслог организма, такође имају свог, мање диференцираног претходника. Заједнички извор за апсолутно све соматске ћелије је ембрионална матична ћелија. Треба напоменути да концепти „ембрионалне матичне ћелије“ и „ембрионалне матичне ћелије“ никако нису идентични. Ембрионалне матичне ћелије је изоловао Џ. Томсон из унутрашње ћелијске масе бластоцисте и пренео их у дугоживеће ћелијске линије. Само ове ћелије имају факсимил „ЕМЦ“. Лерој Стивенс, који је открио ембрионалне матичне ћелије у експериментима на мишевима, назвао их је „ембрионалним плурипотентним матичним ћелијама“, мислећи на способност ЕМЦ да се диференцирају у деривате сва три клицина слоја (екто-, мезо- и ендодерм). Међутим, све ћелије ембриона у каснијим фазама развоја су такође матичне ћелије, јер оне дају порекло огромном броју ћелија које формирају тело одрасле особе. Да бисмо их дефинисали, предлажемо термин „ембрионалне плурипотентне прогениторске ћелије“.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Врсте матичних ћелија

Савремена класификација матичних ћелија заснива се на принципу њихове поделе према способности (потенцији) да дају ћелијске линије, што се дефинише као тоти-, плури-, мулти-, поли-, би- и унипотентност. Тотипотентност, односно способност рекреирања генетски програмираног организма у целини, поседују зиготне ћелије, бластомери и ембрионалне матичне ћелије (ћелије унутрашње масе бластоцисте). Другу групу тотипотентних ћелија, које се формирају у каснијим фазама ембрионалног развоја, представљају примарне герминативне ћелије ембрионалне гениталне зоне (генитални туберкулуси). Плурипотентност, што је способност диференцијације у ћелије било ког органа или ткива, својствена је ембрионалним ћелијама три клицина слоја - екто-, мезо- и ендодерма. Сматра се да је мултипотентност, односно способност формирања било којих ћелија унутар једне специјализоване линије, карактеристична само за две врсте ћелија: такозване мезенхималне матичне ћелије, које се формирају у неуралном гребену и прекурсори су свих ћелија везивне ткивне базе тела, укључујући и ћелије неуроглије, као и хематопоетске хематопоетске матичне ћелије, које дају почетак свим линијама крвних ћелија. Поред тога, разликују се би- и унипотентне матичне ћелије, посебно ћелије прекурсори мијелоидних, лимфоидних, моноцитних и мегакариоцитних хематопоетских клица. Постојање унипотентних матичних ћелија јасно је доказано на примеру ћелија јетре - губитак значајног дела ткива јетре надокнађује се интензивном деобом диференцираних полиплоидних хепатоцита.

Током развоја, сви органи и ткива се формирају као резултат пролиферације и диференцијације унутрашње ћелијске масе бластоцисте, чије су ћелије, у строгом смислу, тотипотентне ембрионалне матичне ћелије. Први рад на изолацији ембрионалних матичних ћелија спровео је Еванс, који је показао да бластоцисте имплантиране у мозак мишева дају настанак тератокарцинома, чије ћелије, када се клонирају, формирају линије плурипотентних ембрионалних матичних ћелија (оригинални назив ових ћелија - ћелије ембрионалног карцинома или у скраћеници ECС - тренутно се не користи). Ови подаци су потврђени у низу других студија у којима су ембрионалне матичне ћелије добијене култивацијом ћелија бластоцисте мишева и других животињских врста, као и људи.

Последњих година, литература све више извештава о пластичности матичних ћелија, која се сматра не само способности ових последњих да се диференцирају у различите типове ћелија у различитим фазама развоја, већ и да се подвргну дедиференцијацији (трансдиференцијацији, ретродиференцијацији). То јест, признаје се фундаментална могућност повратка соматске диференциране ћелије у фазу ембрионалног развоја са рекапитулацијом (повратком) плурипотентности и њеном имплементацијом у поновљеној диференцијацији са формирањем ћелија различитог типа. Посебно се извештава да су хематопоетске матичне ћелије способне за трансдиференцијацију са формирањем хепатоцита, кардиомиобласта и ендотелиоцита.

Научне дебате у вези са поделом матичних ћелија према њиховој пластичности се настављају, односно терминологија и речник ћелијске трансплантације су у процесу формирања, што има директан практични значај, будући да се већина метода регенеративне пластичне медицине заснива на коришћењу пластичних својстава и способности матичних ћелија да се диференцирају у различите ћелијске линије.

Број публикација из области фундаменталних и примењених проблема регенеративно-пластичне медицине брзо расте. Већ је изложен низ различитих методолошких приступа усмерених на најоптималније коришћење регенеративно-пластичног потенцијала матичних ћелија. Кардиолози и ендокринолози, неуролози и неурохирурзи, трансплантолози и хематолози идентификовали су своје области хитног интересовања. Офталмолози, фтизиолози, пулмолози, нефролози, онколози, генетичари, педијатри, гастроентеролози, терапеути и педијатри, хирурзи и акушери-гинеколози траже решење за хитне проблеме у пластичним могућностима матичних ћелија - сви представници савремене медицине надају се да ће добити прилику да лече болести које су се раније сматрале фаталним.

Да ли је трансплантација ћелија следећи „лек за све“?

Ово питање се сасвим оправдано поставља код свих промишљених лекара и научника који анализирају тренутно стање медицинске науке. Ситуацију компликује чињеница да су на једној страни поља научне конфронтације „здрави конзервативци“, а на другој – „болесни фанатици“ ћелијске трансплантологије. Очигледно је да је истина, као и увек, између њих – у „ничијој земљи“. Не дотичући се питања права, етике, религије и морала, размотримо предности и мане одређених области регенеративно-пластичне медицине. „Лагани поветарац“ првих научних извештаја о терапијским могућностима ембрионалних матичних ћелија претворио се у „олујни ветар“ годину дана након њиховог открића, који се 2003. године завртео у „информациони торнадо“. Прва серија публикација бавила се питањима култивације ембрионалних матичних ћелија, њихове репродукције и усмерене диференцијације in vitro.

Испоставило се да је за неограничену репродукцију ембрионалних матичних ћелија у култури неопходно строго поштовати низ услова. У условљеном медијуму морају бити присутна три фактора: интерлеукин-6 (IL-6), фактор матичних ћелија (SCF) и фактор инхибиције леуказа (LIF). Поред тога, ембрионалне матичне ћелије морају се гајити на супстрату (хранионом слоју ћелија) ембрионалних фибробласта и у присуству феталног телећег серума. Ако су ови услови испуњени, ембрионалне матичне ћелије у култури расту као клонови и формирају ембриоидна тела - агрегате суспензионих клонова сферних ћелија. Најважнија карактеристика клона ембрионалних матичних ћелија је да у култури ембриоидно тело престаје да расте када се у агрегату акумулира 50-60, максимално 100 ћелија. Током овог периода наступа равнотежно стање - брзина ћелијске деобе унутар клона једнака је брзини апоптозе (програмиране ћелијске смрти) на његовој периферији. Након постизања такве динамичке равнотеже, периферне ћелије ембриоидног тела подлежу спонтаној диференцијацији (обично са формирањем ендодермалних фрагмената жуманчане кесе, ангиобласта и ендотелиоцита) са губитком тотипотентности. Стога, да би се добила довољна количина тотипотентне ћелијске масе, ембриоидно тело мора бити недељно разложено трансплантацијом појединачних ембрионалних матичних ћелија у нови хранљиви медијум - што је прилично радно интензиван процес.

Откриће ембрионалних матичних ћелија није одговорило на питање шта тачно и како покреће програме ембриогенезе шифроване у ДНК зиготе. Остаје нејасно како се програм генома одвија током људског живота. Истовремено, проучавање ембрионалних матичних ћелија омогућило је развој концепта механизама за одржавање тоти-, плури- и мултипотентности матичних ћелија током њихове деобе. Главна карактеристика матичне ћелије је њена способност саморепродукције. То значи да се матична ћелија, за разлику од диференциране ћелије, дели асиметрично: једна од ћерки ћелија даје настатак специјализованој ћелијској линији, а друга задржава тоти-, плури- или мултипотентност генома. Остало је нејасно зашто и како се овај процес одвија у најранијим фазама ембриогенезе, када је унутрашња ћелијска маса бластоцисте која се дели у потпуности тотипотентна, а геном ЕСЦ је у успаваном (спавајућем, инхибираном) стању. Ако током деобе обичне ћелије процесу дупликације нужно претходи активација и експресија читавог комплекса гена, онда се током деобе ЕСЦ то не дешава. Одговор на питање „зашто“ добијен је након открића већ постојеће иРНК (пре-иРНК) у ембрионалним ћелијама (ЕСЦ), од којих се неке формирају у фоликуларним ћелијама и складиште у цитоплазми јајне ћелије и зиготе. Друго откриће одговорило је на питање „како“: у ЕСЦ пронађени су посебни ензими названи „едитазе“. Едитазе обављају три важне функције. Прво, оне обезбеђују алтернативно епигенетско (без учешћа генома) очитавање и дупликацију пре-иРНК. Друго, оне спроводе процес активације пре-иРНК (сплајсовање - исецање интрона, односно неактивних делова РНК који инхибирају процес синтезе протеина на иРНК), након чега почиње склапање протеинских молекула у ћелији. Треће, едитазе подстичу формирање секундарних иРНК, које су репресори механизама експресије гена, што одржава густо паковање хроматина и неактивно стање гена. Протеински производи синтетизовани на таквим секундарним иРНК и названи протеини пригушивачи или чувари генома присутни су у људским јајним ћелијама.

Тако се данас представља механизам формирања бесмртних ћелијских линија ембрионалних матичних ћелија. Једноставно речено, сигнал за покретање програма ембриогенезе, чије се почетне фазе састоје од формирања тотипотентне ћелијске масе, долази из цитоплазме јајне ћелије. Ако се у овој фази унутрашња ћелијска маса бластоцисте, односно ЕСЦ, изолује од даљих регулаторних сигнала, процес саморепродукције ћелија се одвија у затвореном циклусу без учешћа гена ћелијског једра (епигенетски). Ако се таквој ћелији обезбеди хранљиви материјал и изолује од спољашњих сигнала који подстичу диференцијацију ћелијске масе, она ће се делити и репродуковати своју врсту у недоглед.

Први резултати експерименталних покушаја коришћења тотипотентних ћелија за трансплантацију били су прилично импресивни: уношење ембрионалних матичних ћелија у ткива мишева са имунолошким системом ослабљеним имуносупресорима довело је до развоја тумора у 100% случајева. Међу ћелијама неоплазме, чији су извор биле ембрионалне матичне ћелије (ЕМЦ), постојали су диференцирани деривати тотипотентног егзогеног ћелијског материјала, посебно неурони, али је раст тератокарцинома свео вредност добијених резултата на нулу. Истовремено, у радовима Л. Стивенса, ЕМЦ унете у трбушну дупљу формирале су велике агрегате у којима су фрагментарно формирани ембрионални мишићи, срце, коса, кожа, кости, мишићи и нервно ткиво. (Хирурзи који су отварали дермоидне цисте требало би да буду упознати са овом сликом). Занимљиво је да се суспендоване мишје ембриобластне ћелије понашају на потпуно исти начин: њихово уношење у ткива одраслих имунокомпромитованих животиња увек изазива формирање тератокарцинома. Али ако се из таквог тумора изолује чиста линија ембрионалних ћелија (ЕСЦ) и унесе у трбушну дупљу, онда се поново формирају специјализовани соматски деривати сва три клицина слоја без знакова канцерогенезе.

Дакле, следећи проблем који је требало решити био је пречишћавање ћелијског материјала од нечистоћа недиференцираних ћелија. Међутим, чак и уз веома високу ефикасност циљане ћелијске диференцијације, до 20% ћелија у култури задржава свој тотипотентни потенцијал, који се in vivo, нажалост, реализује у расту тумора. Још једна „праћка“ природе – на скали медицинског ризика, гаранција опоравка пацијента балансира се са гаранцијом његове смрти.

Однос између туморских ћелија и ембрионалних плурипотентних прогениторских ћелија (ЕППЦ), које су напредније у развоју од ЕМЦ, је прилично двосмислен. Резултати наших студија су показали да уношење ЕППЦ у различите трансплантабилне туморе код пацова може довести до дезинтеграције туморског ткива (Г), брзог повећања масе тумора (Д), његовог смањења (Е-3), или не утиче на величину спонтане централне фокалне некрозе неопластичног ткива (И, К). Очигледно је да је резултат интеракције ЕППЦ и туморских ћелија одређен укупним скупом цитокина и фактора раста које оне производе in vivo.

Важно је напоменути да се ембрионалне матичне ћелије, реагујући канцерогенезом на контакт са ткивима одраслих, савршено асимилују са ћелијском масом ембриона, интегришући се у све органе ембриона. Такве химере, које се састоје од сопствених ћелија ембриона и донорских ембрионалних стволних ћелија (ESC), називају се алофенским животињама, иако, у ствари, нису фенотипске химере. Хематопоетски систем, кожа, нервно ткиво, јетра и танко црево подлежу максималној ћелијској химеризацији када се ESC унесу у рани ембрион. Описани су случајеви химеризације гениталија. Једина зона која је неповредива за ESC су примарне клице.

То јест, ембрион задржава генетске информације својих родитеља, што штити чистоћу и наставак и рода и врсте.

У условима блокаде ћелијске деобе раног ембриона употребом цитоклазина, уношење ембрионалних матичних ћелија у бластоцисту доводи до развоја ембриона чије су примарне клице, као и све остале, формиране од донорских ембрионалних матичних ћелија. Али у овом случају, сам ембрион је потпуно донорски, генетски стран телу сурогат мајке. Механизми таквог природног блокирања потенцијала за мешање сопствених и страних наследних информација још нису разјашњени. Може се претпоставити да се у овом случају реализује програм апоптозе, чије нам детерминанте још нису познате.

Треба напоменути да ембриогенеза животиња различитих врста никада није координисана: приликом спровођења донорског програма органогенезе у телу ембриона примаоца ксеногених ембрионалних матичних ћелија, ембрион умире у материци и ресорбује се. Стога, постојање химера „пацов-миш“, „свиња-крава“, „човек-пацов“ треба схватити као ћелијски, али не и морфолошки мозаицизам. Другим речима, када се ембрионалне створеће ћелије једне врсте сисара унесу у бластоцисту друге врсте, увек се развијају потомци мајчине врсте, у којима се, међу сопственим ћелијама готово свих органа, налазе инклузије, а понекад и кластери структурних и функционалних јединица које се састоје од генетски страног материјала деривата ембрионалних створених ћелија. Термин „хуманизована свиња“ не може се схватити као ознака неке врсте чудовишта обдареног интелигенцијом или спољашњим карактеристикама човека. То је само животиња, чији део телесних ћелија потиче од људских ембрионалних створених ћелија унетих у бластоцисту свиње.

Перспективе за употребу матичних ћелија

Одавно је познато да се болести повезане са генопатологијом ћелија хематопоетске и лимфоидне лозе често елиминишу након алогене трансплантације коштане сржи. Замена сопственог хематопоетског ткива генетски нормалним ћелијама од сродног донора доводи до делимичног, а понекад и потпуног опоравка пацијента. Међу генетским болестима које се лече алогеном трансплантацијом коштане сржи, вреди истаћи синдром комбиноване имунодефицијенције, X-везану агамаглобулинемију, хроничну грануломатозу, Вискот-Олдричов синдром, Гошеову и Хурлерову болест, адренолеукодистрофију, метахроматску леукодистрофију, анемију српастих ћелија, таласемију, Фанконијеву анемију и СИДУ. Главни проблем у примени алогене трансплантације коштане сржи у лечењу ових болести повезан је са избором HbA-компатибилног сродног донора, за чију успешну потрагу је потребно просечно 100.000 узорака типизираног донорског хематопоетског ткива.

Генска терапија омогућава исправљање генетског дефекта директно у хематопоетским матичним ћелијама пацијента. Теоретски, генска терапија пружа исте предности у лечењу генетских болести хематопоетског система као и алогена трансплантација коштане сржи, али без свих могућих имунолошких компликација. Међутим, ово захтева технику која омогућава ефикасан пренос пуноправног гена у хематопоетске матичне ћелије и одржавање потребног нивоа његове експресије, који код одређених врста наследне патологије можда није веома висок. У овом случају, чак и благо надокнађивање протеинског производа дефицитарног гена даје позитиван клинички ефекат. Конкретно, код хемофилије Б, 10-20% нормалног нивоа фактора IX је сасвим довољно да се обнови унутрашњи механизам згрушавања крви. Генетска модификација аутологног ћелијског материјала показала се успешном у експерименталном хемипаркинсонизму (једнострано уништавање допаминергичких неурона). Трансфекција фибробласта ембриона пацова ретровирусним вектором који садржи ген тирозин хидроксилазе обезбедила је синтезу допамина у централном нервном систему: интрацеребрална примена трансфектованих фибробласта нагло је смањила интензитет клиничких манифестација експерименталног модела Паркинсонове болести код експерименталних животиња.

Перспектива коришћења матичних ћелија за генску терапију људских болести поставила је многе нове изазове за клиничаре и експериментаторе. Проблематични аспекти генске терапије повезани су са развојем безбедног и ефикасног система за транспорт гена у циљну ћелију. Тренутно је ефикасност трансфера гена у велике ћелије сисара веома ниска (1%). Методички, овај проблем се решава на различите начине. Ин витро трансфер гена подразумева трансфекцију генетског материјала у ћелије пацијента у култури, са њиховим накнадним повратком у тело пацијента. Овај приступ треба препознати као оптималан када се користе гени унети у матичне ћелије коштане сржи, јер су методе за пренос хематопоетских ћелија из тела у културу и назад добро успостављене. Ретровируси се најчешће користе за пренос гена у хематопоетске ћелије ин витро. Међутим, највећи део хематопоетских матичних ћелија је у стању мировања, што компликује транспорт генетских информација помоћу ретровируса и захтева потрагу за новим начинима ефикасног транспорта гена у успаване матичне ћелије. Тренутно се користе методе преноса гена као што су трансфекција, директно микроињекција ДНК у ћелије, липофекција, електропорација, „генски пиштољ“, механичко купловање помоћу стаклених перли, трансфекција хепатоцита са рецептор-зависним купловањем ДНК за асиалогликопротеин и аеросолошко уношење трансгена у ћелије алвеоларног епитела плућа. Ефикасност преноса ДНК овим методама је 10,0-0,01%. Другим речима, у зависности од начина уношења генетске информације, успех се може очекивати код 10 пацијената од 100 или код 1 пацијента од 10.000 пацијената. Очигледно је да ефикасан и истовремено безбедан метод преноса терапијских гена тек треба да буде развијен.

Фундаментално другачије решење проблема одбацивања алогеног ћелијског материјала у ћелијској трансплантологији је употреба високих доза ембрионалних плурипотентних ћелија прогенитора ради постизања ефекта реинсталације система контроле антигенске хомеостазе одраслог организма (ефекат Кухарчука-Радченка-Сирмана), чија суштина лежи у индукцији имунолошке толеранције стварањем нове базе имунокомпетентних ћелија уз истовремени репрограмирање система контроле антигенске хомеостазе. Након уношења високих доза ЕППЦ, ове друге се фиксирају у ткивима тимуса и коштане сржи. У тимусу, ЕППЦ се, под утицајем специфичног микроокружења, диференцирају у дендритичне, интердигитатне ћелије и епително-стромалне елементе. Током диференцијације ЕППЦ у тимусу примаоца, заједно са сопственим молекулима главног комплекса хистокомпатибилности (МХЦ) примаоца, експресују се и молекули МХЦ који су генетски одређени у ћелијама донора, односно успоставља се двоструки стандард молекула МХЦ, према којем се остварује позитивна и негативна селекција Т-лимфоцита.

Дакле, обнављање ефекторске везе имуног система примаоца се дешава кроз познате механизме позитивне и негативне селекције Т-лимфоцита, али кроз двоструки стандард МХЦ молекула - ЕППЦ примаоца и донора.

Репрограмирање имуног система помоћу ЕППЦ не само да омогућава трансплантацију ћелија без накнадне дуготрајне употребе имуносупресива, већ отвара и потпуно нове перспективе у лечењу аутоимуних болести и пружа упориште за развој нових идеја о процесу старења људи. Да бисмо разумели механизме старења, предложили смо теорију исцрпљивања матичних простора тела. Према главној одредби ове теорије, старење је трајно смањење величине матичних простора тела, што се схвата као пул регионалних („одраслих“) матичних ћелија (мезенхималних, неуронских, хематопоетских матичних ћелија, прогениторских ћелија коже, дигестивног тракта, ендокриног епитела, пигментних ћелија цилијарних набора итд.), које надокнађују ћелијске губитке одговарајућег ткива у процесу ремоделирања тела. Ремоделирање тела је обнављање ћелијског састава свих ткива и органа захваљујући ћелијама матичних простора, које се наставља током целог живота вишећелијског организма. Број ћелија у матичним просторима је генетски одређен, што одређује ограничену величину (пролиферативни потенцијал) сваког матичног простора. Заузврат, величина матичних простора одређује брзину старења појединачних органа, ткива и система тела. Након исцрпљивања ћелијских резерви матичних простора, интензитет и брзина старења вишећелијског организма одређени су механизмима старења соматских диференцираних ћелија унутар Хејфликове границе.

Стога, у фази постнаталне онтогенезе, ширење матичних простора може не само значајно повећати животни век, већ и побољшати квалитет живота обнављањем потенцијала ремоделирања тела. Ширење матичних простора може се постићи уношењем великих доза алогених ембрионалних плурипотентних ћелија прогенитора, под условом да се имуни систем примаоца истовремено репрограмира, што значајно повећава животни век старих мишева у експерименту.

Теорија исцрпљивања матичних простора може променити постојеће идеје не само о механизмима старења, већ и о болести, као и о последицама њеног лечења лековима. Конкретно, болест се може развити као резултат патологије ћелија матичних простора (онкопатологија). Исцрпљивање резерве мезенхималних матичних ћелија ремети процесе ремоделирања везивног ткива, што доводи до појаве спољашњих знакова старења (боре, млавост коже, целулит). Исцрпљивање резерве матичних ћелија ендотелних ћелија узрокује развој артеријске хипертензије и атеросклерозе. Почетно мала величина тимусног матичног простора одређује његову рану трајну инволуцију повезану са старењем. Прерано старење је последица почетног патолошког смањења величине свих матичних простора тела. Медикаментозна и немедикаментозна стимулација резерви матичних ћелија побољшава квалитет живота смањењем његовог трајања, јер смањује величину матичних простора. Ниска ефикасност савремених геропротектора је последица њиховог заштитног дејства на стареће диференциране соматске ћелије, а не на матичне просторе тела.

У закључку, желели бисмо још једном да напоменемо да је регенеративно-пластична медицина нови правац у лечењу људских болести заснован на коришћењу регенеративно-пластичног потенцијала матичних ћелија. У овом случају, пластичност се схвата као способност егзогених или ендогених матичних ћелија да се имплантирају и дају нове специјализоване ћелијске клице у оштећеним деловима ткива оболелог организма. Предмет регенеративно-пластичне медицине су фаталне људске болести које су тренутно неизлечиве, наследна патологија, болести код којих методе традиционалне медицине постижу само симптоматски ефекат, као и анатомски дефекти тела, чија је рестаурација циљ реконструктивно-пластичне регенеративне хирургије. По нашем мишљењу, прерано је сматрати прве покушаје рекреације целих и функционално комплетних органа из матичних ћелија посебном областју практичне медицине. Предмет регенеративно-пластичне медицине су матичне ћелије, које, у зависности од извора њиховог пријема, имају различит регенеративно-пластични потенцијал. Методологија регенеративне пластичне медицине заснива се на трансплантацији матичних ћелија или њихових деривата.