Ембрионалне матичне ћелије

Откриће ембрионалних матичних ћелија није настало случајно, већ се појавило на припремљеном тлу научних истраживања у области развојне биологије. Термин „матична ћелија“ уведен је у медицину 1908. године на конгресу хематолошког друштва у Берлину од стране Александра Максимова у вези са хематопоетским ћелијама. Много пре изолације и производње стабилних линија плурипотентних ембрионалних матичних ћелија, матичне терато-(ембрио-карциномске) ћелије су коришћене у проучавањима раних развојних процеса, уз помоћ којих су проучавани непознати механизми ембриогенезе, укључујући секвенцу експресије раних гена и протеинских производа њихове активности.

Али да ли је тотипотентност људског генома неповратно изгубљена у процесу еволуције? Не, а ембриогенеза је доказ за то. Ако је то тако, када ће се онда, у принципу, остварити други пут еволутивног развоја? Вероватно, када човек уђе у свемир, где ће услови околине бити релативно константни довољно дуго. Губитак коштаног ткива (деминерализација костију у стању бестежинског стања), које је веома споро подложно ремоделирању и регенерацији, може се сматрати првим кораком у процесу адаптације човека, као врсте, на постојање у свемирским условима. Међутим, цена за други пут еволутивног развоја биће другачија - цена за повратак тотипотентности и апсолутне пластичности свим ћелијама биће стерилност. Дакле, у овом свету „еволутивних камелеона“, мораћемо да се размножавамо без мејозе, пупљењем. Али ћемо живети дуго. Бесмртност теломеразе је бесмртност амебе. У вишећелијском организму, матичне ћелије су супстрат квантитативне и квалитативне дуговечности.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Извори ембрионалних матичних ћелија

Данас су извори ембрионалних матичних ћелија за лабораторијска истраживања линије тератокарцинома миша (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) и људског тератокарцинома (NTERA-2, TERA-2, H-9 клон), као и Trauneon ESC линије. Међутим, доступност детаљног ћелијског пасоша који указује на имуни фенотип, резултате хромозомске анализе, профиле експресије мРНК, изложене рецепторе и интрацелуларне сигналне протеине не надокнађује значајне недостатке ESC линија тератокарцинома - брз губитак тотипотентности и немогућност њихове употребе у клиничким испитивањима, док мешовита диференцијација у култури веома отежава изоловање чисте специјализоване линије из хетерогене ћелијске популације. Стога је извор ESC линија креираних у клиничке сврхе обично унутрашња ћелијска маса бластоцисте, појединачни бластомери ембриона у стадијуму 8 ћелија, ћелије моруле каснијих стадијума, као и примордијалне клице.

Треба напоменути да ћелије тератокарцинома, иако имају својство плурипотентности, карактерише знатно нижи плурипотентни потенцијал у поређењу са ембрионалним ћелијама (ЕСЦ). Њихова интеграција са ембрионалним ћелијама ретко доводи до формирања химера, које, штавише, никада не формирају гамете са генотипом ћелија тератокарцинома. Сматра се да је то због честе појаве хромозомских абнормалности током култивације ћелија тератокарцинома: губитак Y хромозома, разне трисомије, делеције или транслокације.

Покушаји изоловања људске ЕСЦ линије су више пута вршени, али овај задатак није решен, јер су нормалне људске бластоцисте тешко доступне. Поред тога, учесталост хромозомских абнормалности код људи је већа него у ембриогенези код животиња. Велика већина раних људских ембриона добијених након вантелесне оплодње показује хаотичан хромозомски мозаицизам и често има нумеричке и структурне аберације. Чак и касније, у фази бластоцисте, само 20-25% људских ембриона састоји се од ћелија са нормалним кариотипом. Било је практично немогуће користити такве ембрионе за стварање ЕСЦ, јер су зиготи обично култивисани до фазе са два или четири бластомера, а затим трансплантирани у материцу. Тек релативно недавно је развијена поуздана техника за култивацију оплођених људских јајних ћелија до фазе бластоцисте. Увођење ове технике у праксу вантелесне оплодње не само да је повећало учесталост успешних исхода имплантације, већ је и учинило нормалне бластоцисте приступачнијим објектом.

Још један извор плурипотентних матичних ћелија су примордијалне клице, које, за разлику од напреднијих прогениторских популација герминативног епитела, немају бета-интегрин на својој површини, али испољавају високу активност алкалне фосфатазе. Треба напоменути да се популације матичних ћелија које су настале од примордијалних клица експериментално проучавају од 1980-их. Тада је развијена техника за изоловање примордијалних клица из рудимента гонаде мишјег ембриона. Први неуспешни резултати култивације примордијалних клица in vitro указивали су на узалудност ових покушаја, јер ћелије, иако су преживеле, нису пролиферисале и угинуле су у првом дану. Касније је утврђено да се примордијалне клице миша репродукују in vitro само у присуству растворљивих и мембрански везаних специфичних полипептидних фактора раста у медијуму за култивацију. Резултати бројних студија показали су да је за преживљавање и пролиферацију примарних клица неопходно присуство не само LIF-а већ и мембрански везаних и растворљивих Steel фактора (SIF) у медијуму за култивацију. Ове пептиде производе соматске ћелије ембриона хомозиготних за Steel мутацију, а један од њих је лиганд cKit прото-онкогена.

Примарне клице сисара и људи имају екстрагонадно порекло и извор су клонског развоја линије клица. Порекло примордијалне клица, као и свих ембрионалних ткива и екстраембрионског мезодерма, је епибласт (примарни ектодерм) раних ембриона, који има мозаичну структурну организацију. Методом микрохируршког уклањања различитих делова раног ембриона утврђена је зона локализације у епибласту клона посвећених прекурсора примордијалних клица. Коришћењем родамин декстрана, који је коришћен као ћелијски маркер, утврђено је да су прекурсори примордијалних клица локализовани у проксималном региону епибласта, близу екстраембрионског ектодерма. Примордијална клица настаје из клона од 45 ћелија, чија се алокација дешава на самом почетку гаструлације. Затим се клон сегрегира, а током гаструлације примарне клице улазе у екстраембрионални мезодерм и налазе се у основи алантоисног рудимента, иза примарне пруге. Одатле примарне клице мигрирају ка вентралном делу ендодерма задњег црева, а затим се активно крећу дуж мезентерија, насељавајући гениталне гребене на крају миграције. Током миграције, као и у прва 2-3 дана локализације у гонадном рудименту, примарне клице се активно размножавају и пролазе кроз осам репликативних циклуса. Ако на почетку миграције постоји око 50 примарних клице, онда у гениталним гребенима мишјих ембриона дванаест дана развоја број примарних клице прелази 25.000.

Функционална сличност ембрионалних ћелија (ESC) и примордијалних герминативних ћелија доказана је потпуном интеграцијом ових других у бластоцисту са заменом унутрашње ћелијске масе и накнадним потпуним развојем ембриона, чија ткива се састоје само од потомака примордијалних герминативних ћелија. У другим својствима, примордијалне герминативне ћелије миша су се такође показале идентичним ESC, демонстрирајући способност диференцијације у различитим правцима, формирања ембриоидних тела in vitro и формирања тератома in vivo када се примењују поткожно имунодефицијентним мишевима, подсећајући на спонтане тестикуларне тератоме код 129/ter мишева.

Утврђено је да када се у медијум додају LIF, мембрански везани и растворљиви SIF, изоловане примарне клице мишјих ембриона старих 8 дана преживљавају и размножавају се у култури 4 дана, али затим умиру. Штавише, период када се у култури примећује смрт примарних клица поклапа се са фазом развоја мишјих ембриона (12,5-13,5 дана) када женске примарне клице улазе у мејозу у рудиментима гонада, а митотске деобе су блокиране код мушких примарних клица. Међутим, ако се у медијум додају не само фактори раста LIF и SIF, већ и FGF2, примарне клице настављају да се размножавају, а у субкултурама се формирају колоније ћелија способних за размножавање чак и након уклањања фактора раста (SIF и FGF) из медијума. Такве ћелије се могу дуго култивисати на супстрату ембрионалних фибробласта без додавања растворљивог фактора раста LIF. Предложено је да се ове стабилне ћелијске линије добијене из примордијалних клица називају ембрионалним клицама. Овај термин није нимало успешан, јер је немогуће добити ембрионалне клице способне за обављање наредних фаза оогенезе или сперматогенезе приликом култивације ЕГ ћелија. То је због чињенице да ЕГ ћелијске линије, иако потичу од примордијалних клицевих ћелија, али, стичући својства ембрионалних плурипотентних матичних ћелија у култури, губе способност да се обавежу на клицеве лозе. Другим речима, примордијалне клице, када се култивишу, губе својства прекурсора гамета и трансформишу се у плурипотентне ћелије сличне ЕСК.

Примећено је да тератоми не настају када се ЕГ ћелије унесу у имунодефицијентне мишеве. Претпоставља се да је губитак способности људских ЕГ ћелија да доведу до тератома последица чињенице да ове линије нису створене директно из култивисаних примарних герминативних ћелија, већ су добијене из ћелија изолованих из ембриоидних тела. Стога је могуће да су потомци плурипотентних, али већ асоцираних ћелија.

Треба напоменути да постоје фундаменталне разлике између ЕГ ћелија и примордијалних герминативних ћелија. Потоње не дозвољавају добијање химерних мишјих ембриона, што указује на недостатак способности примордијалних герминативних ћелија да се интегришу у унутрашњу ћелијску масу или трофектодерм. Карактеристике популације примордијалних герминативних ћелија су сличније посвећеним линијама соматских ћелија каснијих ембриона, чије уношење у бластоцисту такође не доводи до формирања химерних ембриона.

Модификација технике култивације ембриоидних тела добијених агрегацијом ЕГ ћелија омогућила је добијање још једне популације плурипотентних ћелија, названих „ћелије изведене из ембриоидних тела“ (ЕБД ћелије), коришћењем селекције на селективним медијумима. Способност ЕБД ћелија да се размножавају у култури током дужег времена омогућила је стварање стабилних ћелијских линија посвећених ћелија. Добијени су клонови ћелија које експресују широк спектар мРНК и протеинских маркера специјализованих ћелија. Овај приступ је на крају доказао да су људске примарне клице плурипотентне и да се ин витро диференцирају у различите типове ћелија: неуроне, неуроглију, васкуларни ендотел, хематопоетске ћелије, мишићне и ендодермалне ћелије.

Алтернативни извори ембрионалних матичних ћелија

Алтернативни извор људских ЕСЦ линија могу бити хибридне ћелије. Имплантација у материцу псеудогравидних крава хетерогеног конструкта добијеног фузијом електропорацијом соматских ћелија људског фетуса са крављом јајном ћелијом из које је претходно уклоњен пронуклеус омогућава добијање унутрашње ћелијске масе из вештачког ембриона преимплантационих фаза развоја. У ту сврху, у првој фази се добија бластоциста из кравље јајне ћелије са трансплантираним једром људске ћелије.

У другој фази, ембриобласт се изолује из бластоцисте, а из њега се ЕСЦ изолују помоћу Томсонове методе. Важно је напоменути да су најбољи резултати у изоловању ЕСЦ линија коришћењем ове методе добијени коришћењем језгара фоликуларних ћелија или примарних герминативних ћелија које остају у људском телу у стању хибернације. То је због чињенице да језгра људских ћелија трансплантираних у кравље јаје морају имати нескраћене теломере и високу теломеазну активност, што помаже у избегавању превременог старења ЕСЦ клонова добијених из хибридне јајне ћелије (Репин, 2001). Познато је да су најважнији интрацелуларни маркер протеини ЕСЦ Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, који припадају такозваним протеинима пригушивача хроматина. Пригушивачи пружају посебно компактно паковање хетерохроматина, што спречава формирање еухроматинских петљи. Паковање хроматина посредовано овим протеинима корелира са тотипотенцијом ЕСЦ генома. До данас је утврђено да су зреле говеђе и људске ооците једина врста специјализованих ћелија које садрже високе концентрације протеина пригушивача у цитоплазми. На основу тога, развијен је метод за добијање хибридних ЕСЦ преносом језгара соматских ћелија у енуклеиране говеђе ооците. Прелиминарне in vitro студије су показале да цитоплазма говеђих ооцита обнавља тотипотентност генома језгара људских соматских ћелија након 12-24 сата култивације.

Од посебног интереса су подаци о особеностима преимплантационог развоја људских ембриона, што указује на каснију замену тотипотентних ћелија популацијом плурипотентних ћелија него код мишева. Студија ћелијских трансформација показала је да ћелије трофобласта такође настају из ћелија унутрашње ћелијске масе људских бластоциста, поред ембрионских ћелија (ESC), што указује на њихову укупну потенцију.

Познато је да у фази бластоцисте настају две различито посвећене ћелијске популације. Једна од њих формира спољашњи слој бластоцисте - трофектодерм, чији су деривати ћелије трофобласта и друге ембрионалне компоненте плаценте. Друга популација ћелија је груписана у густу масу која контактира унутрашњу површину трофектодерма. Деривати популације ћелија унутрашње ћелијске масе су сва ткива и рудименти органа ембриона. У фази касне бластоцисте, екстраембрионални ендодерм се формира из унутрашње ћелијске масе и формира се епибласт (примарни ектодерм). У овом случају, ћелије епибласта задржавају плурипотентност, док је способност диференцијације ћелија екстраембрионалног ендодерма ограничена.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Добијање људских ембрионалних матичних ћелија

До недавно се веровало да је немогуће добити ембрионалне стволове (ESC) из трофобласта. Међутим, линија диплоидних матичних ћелија трофектодерма изолованих из бластоцисте пролиферира и трансформише се у матичне ћелије у медијуму који садржи FGF2 и хепарин уместо LIF. Ако се FGF2 уклони из медијума, ћелије трофектодерма престају да се множе, у њима почиње ендоредупликација хромозома, а ћелијски елементи трофектодерма се постепено трансформишу у џиновске ћелије трофобласта. Вероватно, LIF не стимулише пролиферацију ћелија трофектодерма због чињенице да FGF2 покреће другачији механизам транс-сигнализације, пошто FGF2, везујући се за плазма рецептор (FGFR2), активира MAP киназе у цитоплазми - ERK1 и ERK2. Сходно томе, када се један сигнални пут (LIF - gpl30 - JAK киназа - STAT3) укључи у ћелијама бластоцисте, ћелије унутрашње ћелијске масе се трансформишу у плурипотентне ембрионалне ћелијске ћелије (ESC), а када се активира други механизам трансмембранске преносе сигнала (FGF2 - FGFR2 - MAP киназа ERK1/ERK2), у бластоцисти се формирају матичне ћелије трофектодерма. Избор сигналног пута, заузврат, зависи од активности гена oct4. Овај ген, који припада POU домену, налази се у t локусу аутозома 17 и експресује се током оогенезе, током периода цепања, као и у ћелијама унутрашње ћелијске масе бластоцисте и у примарним герминативним ћелијама. Функционална улога гена oct4 је да кодира транскрипциони фактор неопходан за настанак плурипотентних ћелија, њихову диференцијацију и дедиференцијацију.

Експресија гена oct4 у ембрионалним ћелијским ћелијама (ESC) варира у зависности од интеракције овог транскрипционог фактора са кофакторима. Усмерена регулација експресије oct4 у бластоцистама показала је да када је његова активност смањена, половина ћелија формира трофектодерм, док када се индукована експресија oct4 повећа, претежно настају ESC.

У експерименту, ЕСЦ се не могу пренети у линију током култивације тотипотентних бластомера у фази цепања, као ни у фази гаструлације и каснијим фазама ембрионалног развоја. Мишји ЕСЦ се обично изолују 3,5-4,5 дана трудноће, што одговара шестој (једнослојна бластоциста) и седмој фази (двослојна бластоциста - рани јајни цилиндар) нормалне ембриогенезе. Очигледно је да само у преимплантационом периоду мишји ембриони садрже ћелијске популације способне за трансформацију у ЕСЦ. Сходно томе, изолација ЕСЦ линија је могућа само у одређеним фазама ембриогенезе. Зигот и бластомери који настају током цепања су тотипотентни, са становишта могућности развоја одрживог ембриона са ембрионалним мембранама и плацентом. Губитак укупне потенције герминативних ћелија почиње у касној фази моруле, када даље везивање бластомера зависи од њихове локације. Рани бластомери моруле задржавају тотипотентност, јер експерименталне манипулације са променама у њиховој локализацији, као што је инверзија њихове локације, не спречавају развој пуноправног ембриона.

Утврђено је да на ефикасност изоловања ембрионалних матичних ћелија у линију утиче стање бластоциста у време њихове експлантације. Употреба бластоциста након моделирања седмодневне дијапаузе у репродуктивном тракту мишева којима је урађена оваријектомија 3,5 дана трудноће и којима је дат прогестерон, олакшава успешнију изолацију ембрионалних матичних ћелијских линија. Претпоставља се да се под таквим условима повећава број бластомера који формирају унутрашњу ћелијску масу. Такође је могуће да се ћелијски циклус продужава и да већина бластомера улази у G0 фазу.

Поред тога, стварање стабилних плурипотентних ЕСЦ линија зависи од генотипа ембриона: ЕСЦ се прилично лако изолују из бластоциста линије мишева 129, много их је теже добити коришћењем CS7BL/6 мишева, а практично је немогуће изоловати ЕСЦ линију из бластоциста CBA/Ca мишева. Очигледно је да рани ембриони имају неке генетске карактеристике које утичу на развој плурипотентне ЕСЦ линије. Ипак, приликом култивације изолованих епибласта, као и селективном селекцијом ћелија које се диференцирају, ЕСЦ линије су ипак изоловане из раних ембриона CBA/Ca мишева.

Доказана стандардна техника за добијање ЕСЦ линија из бластоциста дата је у лабораторијским приручницима о техници експеримената са раним ембрионима. Експерименталне ЕСЦ линије могу се добити и култивисањем изолованог епибласта (примарног ектодерма) 4,5 дана старих мишјих ембриона коришћењем прилично сложене микрохируршке технике и модификованих услова култивације. Интензитет рада овог поступка је оправдан, јер се учесталост формирања ЕСЦ линија у овом случају показала знатно већом него у радовима са унутрашњом ћелијском масом бластоцисте.

Да би се изоловале ЕСЦ линије, сваки клон се преноси у микројаз, узгаја се агрегат од 40-60 ћелија, а затим се поново диспергују. Вишеструко понављање овог поступка нам омогућава да добијемо иммортализовану ЕСЦ линију са максималном стопом пролиферације нормокариотипских ћелија причвршћених за пластику, које задржавају тотипотентност и високу теломеразну активност након 50-100 пасажа. У процесу одржавања ЕСЦ линија, највећа опасност је контаминација подлоге или серума бактеријским ендотоксинима - чак и трагови концентрација ендотоксина у подлози за култивацију изазивају масовну смрт незрелих герминативних ћелија. Пажљивим праћењем линеарног раста и благовременом дисперзијом, ЕСЦ у култури су способне за симетричну деобу, у којој обе ћерке ћелије остају плурипотентне и способне да изврше неограничен број ћелијских циклуса, одржавајући диплоидни кариотип и укупну потенцију.

Селекција чисте популације људских ЕСЦ може се извршити након трансфекције њиховог генома рекомбинантним молекулима ДНК који садрже ген који кодира синтезу зеленог флуоресцентног протеина (GFP). Експресија GFP се повећава када се ЕСЦ гаје у условима који подржавају њихову пролиферацију, док се са почетком диференцијације ниво експресије овог гена смањује, што омогућава селекцију чистих стабилних плурипотентних ћелијских линија на селективној подлози. Приликом култивације ЕСЦ изолованих помоћу GFP селекције, учесталост формирања колонија се вишеструко повећава, пошто се снажан антипролиферативни ефекат диференцираних ћелија елиминише у условима селекционих култура.

Транслација људских ембрионалних матичних ћелија у линију врши се методом њихове изолације из преимплантационих ембриона (у фази 80-120 ћелија), који преостају након поступка ин витро оплодње. У ту сврху, вештачки добијени „вишак“ ембриона се механички диспергује у Делбеко-Игловој подлози. Након обележавања ћелија селективним моноклонским антителима са флуоресцентном ознаком, изолују се ћелије ембриобласта. Ембриобласт се диспергује у појединачне ћелије коришћењем смеше диспазе-колагеназе. Дисоциране ћелије се гаје у посебној подлози (80% Делбекова подлога + 20% феталног телећег серума у присуству 500 μг/мл ИЛ-6, ЛИФ и СКФ) преко хранилице-монослоја ембрионалних фибробласта прва 3 пасажа. У овом случају, преживљавање и пролиферација матичних и прогениторских ћелија се одржавају захваљујући дејству ИЛ-6, ЛИФ и СКФ. У таквом медијуму, ембрионалне ембрионалне ћелије (ЕСЦ) расту као суспензиони клонови непричвршћених згуснутих ћелија, које се морају дисоцирати меким, поновљеним пипетирањем. Нови клонови се појављују у суспендованој култури 5-7. дана. Максимална брзина раста ЕСЦ постиже се поновљеном дисоцијацијом клонова у фази од 10-15 ћелија. Затим се сваки клон преноси у микрокутију и узгаја до агрегата од 40-50 ћелија. Поступак се понавља више пута у пасажима, повећавајући запремину културе до густине од 5-10 милиона ћелија по посуди од 6 цм. Користећи такво пасирање, Томсон је изоловао 10 бесмртних клонова људских ЕСЦ, који су након 100 пасажа задржали високу теломеразну активност, способност снажног размножавања, минималне фенотипске карактеристике и укупну потенцију са способношћу диференцијације у било коју од 350 специјализованих ћелијских линија изведених из екто-, мезо- и ендодерма. Диференцијација људских ембрионалних ћелија (ЕСЦ) почела је (након промене подлоге, додавања серума и елиминације LIF-а) са ћелијским везивањем за супстрат, што указује на развој цитоскелета и експресију адхезионих рецептора. Важно је напоменути да су, уз неограничену пролиферацију, људске ембрионалне ћелије (ЕСЦ) задржале нормалан кариотип.

Други метод изоловања људских ЕСЦ линија заснива се на употреби примарних герминативних ћелија. Експерименталне студије су показале да се Е ћелијске линије могу добити из гениталних набора мишјих ембриона старих 12,5 дана. Међутим, у овим случајевима учесталост формирања прогениторских ћелијских линија била је значајно нижа него у експериментима са ранијим ембрионима. Истовремено, примарне герминативне ћелије из гонада мишјих ембриона гестацијске старости од 13,5 дана нису способне да се уопште трансформишу у линије.

Прве стабилне линије плурипотентних људских ЕГ ћелија добијене су из примарних гоноцита изолованих из гонада ембриона старих 5-9 недеља. Изоловане ћелије су култивисане на супстрату инактивираних мишјих ембрионалних фибробласта у ДМЕМ медијуму са феталним серумом допуњеним меркаптоетанолом, форсколином и рекомбинантним људским факторима раста (ФГФ и ЛИФ). Након 7-12 дана, у култури су се појавиле вишећелијске колоније, које по морфолошким карактеристикама и молекуларним маркерима одговарају људским ЕГ ћелијама. Након агрегације, ове ћелије су формирале ембриоидна тела, чијим даљим развојем су се појавиле специјализоване ћелије карактеристичне за деривате сва три клицина слоја. Током 10-20 пасажа, ЕГ ћелијске линије су задржале нормалан кариотип и нису изгубиле плурипотентност.

Такође је показано да комбиновано дејство LIF-а, мембрански везаних и растворљивих Steel фактора и TGF-b мења развојни програм примордијалних герминативних ћелија. Уместо да престану са митотским деобама и почну да се диференцирају ка оогенези или сперматогенези, примордијалне герминативне ћелије настављају да се размножавају. Након неколико додатних митотских циклуса, оне постају сличне ћелијама епибласта и, губећи својства прекурсора герминативних ћелија, трансформишу се у плурипотентне ембрионалне матичне EG ћелије.

Тако су 1998. године први пут изоловане иммортализоване линије примордијалних герминативних ћелија из гениталног рудиментa ткива аутопсије људског фетуса. У људској ембриогенези, примордијалне герминативне ћелије се појављују у жуманчаној кеси у 3. недељи развоја, а у 4-5. недељи ове ћелије мигрирају у зону гениталног туберкулуса, где формирају успаване популације примарних гоноцита. У неактивном стању, примордијалне герминативне ћелије се чувају у ембриону до рођења. Линије примордијалних герминативних ћелија се изолују из феталног гениталног туберкулуса ембриона од 5-9 недеља, чије се екстраховано ткиво ex tempore третира смешом колагеназа типова IV-V, хијалуронидазе и ДНазе како би се повећао квантитативни и квалитативни принос ћелија. Примордијалне герминативне ћелије у ткиву феталног гениталног туберкулуса окружене су стромалним (мезенхималним) Сертолијевим ћелијама. Функционална сврха Сертолијевих ћелија је да производе антиапоптотичке факторе (Fas лиганд), митогене и имуносупресанте који штите клице од имуног напада организма. Поред тога, стромално микроокружење гениталног туберкулума игра важну улогу у сазревању гамета. Изоловане примарне клице се засађују у култури преко хранљивог стромалног слоја који се састоји од феталних фибробласта прва три пасажа. Најефикаснија комбинација митогена је комплекс који се састоји од LIF, FGF и форсколина (стимулатора формирања цАМП-а). Пролиферација примарних клице ин витро захтева додатак феталног серума, у чијем присуству је репродукција примарних гоноцита у култури праћена формирањем клонова сферних ћелија које нису везане за подлогу.

У Националним институтима за здравље САД, на основу резимеа постојећих података о методама за изоловање линија људских ембрионалних ћелија (ESC) из бластоциста, донет је прелиминарни закључак да је успешна изолација ESC највероватнија приликом култивације бластоциста са добро формираном унутрашњом ћелијском масом (Matic cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Са ове тачке гледишта, оптималан извор ESC за стварање линија су људске бластоцисте 5. дана развоја, из којих треба пажљиво уклонити трофектодерм приликом изоловања унутрашње ћелијске масе. Изолована унутрашња ћелијска маса, која се у овој фази састоји од 30-35 ћелија, треба да се култивише на супстрату ембрионалних мишјих фибробласта, што је одлучујући услов за формирање колонија ESC у култури.

Анализа фенотипских карактеристика ембрионалних матичних ћелија

Од посебног интереса је међуспецијска упоредна анализа фенотипских карактеристика ЕСЦ. Утврђено је да су колоније људских ЕСЦ густи кластери спљоштених, епителних ћелија, док се мишја ембриоидна тела састоје од растреситог конгломерата заобљених ћелија. Код људских ЕСЦ, индекс односа нуклеарно-плазма је нижи него код мишјих ЕСЦ. Ембрионалне матичне ћелије мајмуна формирају равније колоније ћелија са неравним ивицама. Појединачне ћелије су лако видљиве код раних клонова ЕСЦ примата. Пролиферишуће ЕСЦ свих проучаваних животињских врста не експресују молекуле МХЦ класе I и II. Истовремено, људске ЕСЦ дају позитивну реакцију на антитела TERA 1-60 и GCTM-2, што указује на присуство протеогликана кератин/хондроитин сулфат на њиховој површини, карактеристичних за матичне ћелије ембрио-(терато)-карцинома. Експресија гена oct4 код ЕСЦ свих животињских врста сугерише да је, упркос фенотипским разликама, исти скуп гена одговорних за одржавање плурипотентности очигледно активиран код људских и мишјих ЕСЦ (Перу, 2001). Поред тога, ЕСЦ линије изоловане из ембриона пацова, свиња, зечева, примата и говеда имају сличне морфолошке карактеристике, сличан скуп молекуларних идентификационих маркера и готово идентичан молекуларни механизам за спровођење програма ембриогенезе, што нам омогућава да на нови начин сагледамо проблем ксенотрансплантације.

За разлику од нормалне ембриогенезе in vivo, пролиферација ЕСЦ in vitro није праћена формирањем клициних слојева и одвија се на позадини блокирања хомеотских Hox гена, тј. без органогенезе. Пошто гени сегментације не функционишу, немогуће је репродуковати такве периоде ембриогенезе као што су полагање сомита, сегментација ембриона, формирање жуманчане кесе, алантоиса и других провизорних органа и ткива у култури ЕСЦ. Култивисане ЕСЦ као да су се замрзнуле на почетку процеса формирања 350 рестрикционих линија специјализованих ћелија. Дакле, клон ћелија-прогенитора ћерке и централно локализована ЕСЦ представљају само модел ембриона, током чијег развоја се истовремено формирају различите линије специјализованих ћелија у различитим регионима ткива, које, међутим, потичу од заједничких прекурсора. Упркос минималном нивоу рецептора на површини ЕСЦ, оне задржавају способност да спроводе примитивне морфогенетске процесе, имитирајући волуметријске структуре раног ембриона: суспензија ЕСЦ у култури се агрегира и формира структуре које подсећају на бластоцисте или чак касније ембрионе (јајне цилиндре). Такви агрегати суспензије се називају једноставна и сложена ембриоидна тела, респективно.

У мешовитој диференцијацији, рани гени ектодерма (oct3, fgf-5, nodal), ендодерма (gata-4), мезодерма (brachyury), кардиогеног мезодерма (pkh-2.5), неуралне цеви (msx3) и хематопоезе (elkf) се истовремено експресују у различитим ћелијама једног ембриоидног тела. Коришћењем различитих комбинација фактора раста и цитокина за циљано деловање на формирање ћелија клициног слоја in vitro, у низу случајева је било могуће добити ембриоидна тела у којима су преференцијално експресовани гени ектодерма или мезодерма, што отвара пут моделирању гаструлације и почетних фаза органогенезе.

Клонски раст ЕСЦ је доказ асиметричне ћелијске деобе, у којој само један ЕСЦ у центру клона задржава неограничен потенцијал пролиферације, док друга ћелија-кћерка генерише генерацију ћелија-прогенитора које већ пролазе кроз диференцијацију. Стога је стопа пролиферације клона на периферији ембриоидног тела већа него у центру. Маргиналне ћелије растућег клона пролазе кроз спонтану поремећену диференцијацију, мигрирају или умиру апоптотским механизмима. Ови догађаји одређују судбину клона: ако стопа пролиферације премаши стопу миграције и апоптотске ћелијске смрти, клон наставља да се повећава у величини, стабилизација се јавља када су стопа апоптозе и стопа формирања нових ћелија једнаке, а регресија се јавља када је однос ових процеса инверзан. Ћелије-прогенитори се деле симетрично, тј. обе ћерке ћелије се потом диференцирају у зреле специјализоване ћелијске линије. Однос ЕСЦ и ћелија-прогенитора варира, али је број ЕСЦ увек само делић процента популације ћелија-прогенитора. Стога, само пажљиво пипетирање и благовремена дисагрегација клонова могу повећати број ЕСЦ у култури. Дисагрегација клонова у фази од 10-12 ћелија показала се најефикаснијом за добијање максималног приноса ембрионалних ћелија (ЕМЦ). Правац и степен диференцијације ћелија у ембрионалном телу зависе од њихове локације. Спољашње ћелије ембрионалног тела не експресују ген oct4 и подлежу диференцијацији у ћелије примарног ендодерма, из којих се накнадно формирају епителне ћелије паријеталног и висцералног екстраембрионалног ендодерма. Унутрашње ћелије ембрионалног тела експресују ген oct4 и задржавају плурипотентност током 48 сати култивације. Међутим, култура се затим морфолошки реструктурира у епителни монослој и почиње експресија гена који контролишу развој примарног ектодерма. Затим, процес тоталне поремећене цитодиференцијације почиње појавом различитих типова ћелија који су деривати сва три клицина слоја. У процесу спонтане диференцијације ћелија ембрионалног тела, први се појављују агрегати са маркерима ендодерма у облику фрагмената (циста) жуманчане кесе. Затим се у овим структурама појављују ангиобласти и ендотелне ћелије растућих капилара. У завршним фазама спонтане диференцијације, из унутрашњих ћелија ембриоидног тела развијају се различите терминално диференциране ћелије, укључујући неуроне, глијалне елементе, кардиомиоците, макрофаге и еритроците. До одређене мере (узимајући у обзир просторну инверзију формирања слојева герминативног ткива), коришћењем ембриоидних тела, могуће је проучавати морфогенетске процесе in vitro и анализирати молекуларне механизме почетних периода ембрионалне цитодиференцијације,као и да се утврди улога специфичних гена у спровођењу ових процеса.

Дакле, унутар клона постоје ћелије у којима су откривени различити програми генетског развоја - ЕСЦ, рани прогенитори и диференцирајуће прогениторске популације. Култивација ЕСЦ методом висеће капи или масовне културе без слоја хранилице и без додавања LIF-а у медијум неизбежно доводи до формирања ембриоидних тела. Морфологија ћелија спољашњег и унутрашњег слоја ембриоидних тела се разликује. Спољашњи слој се састоји од великих, разгранатих ћелија. Њихова површина окренута ка околини прекривена је бројним микроресицама. Спољашњи слој ћелија је одвојен од унутрашњег слоја базалном мембраном која подсећа на Рајхертову мембрану, док су ћелије унутрашњег слоја ембриоидних тела стубчасти епител. Морфолошки, унутрашњи слој, иако садржи много ћелија које се деле, више подсећа на недиференциране колоније ЕСЦ.

Карактеристике људских ембрионалних матичних ћелија

Одсуство паренхиматозно-мезенхималних сигналних интеракција на позадини блокирања гена хомеозе доводи до поремећеног раста ЕСЦ у култури, јер то ремети формирање и развој инфраструктуре привремених органа. Неорганизовани раст и поремећена спонтана диференцијација ЕСЦ у култури последица су одсуства мезенхималног обележавања стромалног оквира будућих органа: in vitro је сасвим могуће формирати милионе хепатоцита, али је немогуће добити један лобулу јетре који укључује структурне и функционалне елементе као што су синуси, Дисеови простори и Купферове ћелије.

Верује се да се плурипотентност ЕСЦ-а остварује искључиво у ембриогенези формирањем ткива и органа ембриона, док су плацента и пупчана врпца деривати трофобласта. ЕСЦ-и затворени у трофектодермалној мембрани секвенцијално генеришу клонове провизорних ћелија које спроводе програм развоја путем комбинаторне иРНК волуметријске топографске матрице Нохтејова, које предодређују просторни распоред, облик и величину, број ћелија провизорних и дефинитивних органа, као и склапање паренхима у структурне и функционалне јединице. Истовремено, ЕСЦ-и остају једини тип ћелија код којих је молекуларни механизам за спровођење њихових потенција потпуно одвојен од генетског програма развоја, а саме ЕСЦ-и су лишене могућности интеракције са другим ћелијама због блокирања и перцепције рецептора и транссигналних система. Међутим, адекватна активација ЕСЦ-а доводи до постепеног развоја програма ембриогенезе, завршавајући се рођењем потпуно формираног организма, који се састоји од милијарди ћелија, спремних за ванматерични живот. На овом краткорочном, али незамисливо дугорочном путу у ћелијском простору, неизбежно настају грешке како у молекуларним механизмима који обезбеђују виталну активност ћелија, тако и у програмима који контролишу њихову пролиферацију, диференцијацију и специјализацију. Стога се у савременој фармакогеномици болести молекуларне структуре и болести ћелијског програмирања разматрају одвојено. Штавише, дејство већине нових лекова усмерено је на корекцију програма диференцијације, пролиферације и органогенезе, као и на регенерацију органа и ткива. Код одраслог организма, ембрионалне ћелијске ћелије (ЕСЦ) омогућавају контролу понашања матичних/прогениторских ћелија трансплантираних у мозак, јетру, слезину, коштану срж и друге људске органе како би се обновио оштећени паренхим органа примаоца диференцијацијом и специјализацијом донорских ћелија на очуваној мезенхималној матрици. У суштини, програм тотипотентности почиње да се реализује на нивоу генома ооцита, зигота и бластомера; међутим, ове ћелије још увек нису клониране и пасиране у количинама неопходним за потребе експерименталне и практичне медицине. Стога, ЕСЦ остају јединствени извор генетских информација које садрже кодове за тродимензионалну мапу ембриона и кодове за линеарно ограничење специјализованих ћелијских линија током гаструлације.

Практично неограничен регенеративни потенцијал ЕСЦ-а је последица чињенице да њихов геном, за разлику од генетског апарата диференцираних соматских ћелија, задржава плурипотентност. Једна од манифестација успављеног стања генетске информације уграђене у ЕСЦ-е је такозвани минимални фенотип - ограничен број рецептора се експресује на површини ЕСЦ-а и, сходно томе, веома мало транс-сигналних програма је распоређено за интеракцију нуклеарног апарата ћелије са њеним микроокружењем. На позадини хибернације гена одговорних за рестрикцију специјализованих ћелијских линија и ћелијску диференцијацију, активира се само око 30 од 500 гена, чији производи обезбеђују везу ћелије са околним микроокружењем. Користећи метод серијске анализе експресије гена, показано је да уз заједнички рад главних функционалних кутија генома које регулишу енергетику и метаболизам у соматским ћелијама и ЕСЦ-има, ове друге имају веома низак ниво мРНК рецептора, Г протеина, секундарних месенджера, транскриптаза, кофактора експресије и репресије, тј. целог система трансмембранског преноса регулаторног сигнала до ћелије. То је због одсуства или веома ниске експресије транссигналних гена. Током периода индуковане диференцијације у геному ЕСЦ-а, 18 функционалних гена синхроно престаје да ради на позадини активације 61 транссигналног гена који контролишу синтезу рецептора ћелијске адхезије, компоненти екстрацелуларног матрикса, рестрикционих транскриптаза и елемената мессенџера система за пренос сигнала до нуклеарног апарата од рецептора ћелијске плазма мембране. Истовремено, блокирана је експресија гена одговорних за синтезу протеина пригушивача, као и коинхибитора експресије гена који обезбеђују тотипотентност генома ЕСЦ-а.

Генски маркери су пронађени за ћелије сва три клицина слоја. Идентификација ектодермалног ћелијског слоја врши се експресијом гена nodal, oct3 и fgf-5, мезодермних ћелија - генима brachyury, zeta-globin, ендодерма - експресијом гена gata-4. У нормалној ембриогенези током периода гаструлације, примећује се активна миграција незрелих популација матичних и прогениторских ћелија, локално обележавајући зоне развоја костију лица лобање, неких делова мозга, периферног нервног система, срчаног проводног система и тимуса, чија се ткива формирају од клонова мигрантских ћелија. Обележавање ћелија раним генима клициних слојева олакшава задатак топографске анализе процеса миграције прекурсорских ћелија у ембриону у развоју. Утврђено је, посебно, да у агрегатима ћелија ембриокарцинома П19, експресија првог мезодермног гена брахиурија почиње током периода смањене експресије гена активатора ткивног плазминогена, а-фетопротеина, кератина 8 и кератина 19, који су маркери првих мигрирајућих мезодермних популација. Сходно томе, формирање ткива мезодермалног порекла почиње тек након завршетка процеса тачкасте миграције и дисперзије мезодермалних прогениторских ћелија.

Упркос изузетно ограниченим фенотипским карактеристикама и одсуству већине транс-сигналних јединица, ЕСЦ и даље експресују неке рецепторске молекуле који се могу користити за њихову идентификацију. Важно је напоменути да су се маркерски антигени ЕСЦ код људи и примата показали као уобичајени. Најчешће се за обележавање ЕСЦ користе обележена антитела на мембрански везане антигене SSEA-3, SSEA-4 (јединствени липидни антигени који представљају комплекс гликолипида GL7 са сијалинском киселином), као и високополимерни гликопротеини TRA-1-81, TRA-1-60. Поред тога, ЕСЦ експресују специфични ембрионални антиген SSEA-1 и ендогену алкалну фосфатазу, као и специфични транскрипциони фактор Oct4. Потоњи је неопходан за одржавање механизама пролиферације ЕСЦ - специфични транскрипциони фактор Oct4 активира експресију гена фактора раста фибробласта 4 и стабилизује експресију оквира гена одговорних за неограничену репликацију ДНК у незрелим ћелијама. Најважнији интрацелуларни маркерски протеини су Oct3, Oct4, Tcf и Groucho, који су повезани са протеинима пригушивача хроматина.

Готово одмах након што су дугогодишњи покушаји култивације ембрионалних ћелија ван тела били успешни и добијене су прве културе матичних ћелија изолованих из мишјих бластоциста и културе примарних герминативних ћелија, започета је фаза истраживања плурипотентног потенцијала ембриона када су оне уведене у ембрионе у раним фазама развоја. Показано је да су у фазама моруле и бластоцисте ембриони способни да формирају химерне ембрионе у којима се потомци донорских ембриона детектују у свим соматским ткивима, па чак и у гаметима. Тако је у развојној биологији, коришћењем ембрионалних ћелија, успостављен „мост“ између експерименталних студија in vivo и in vitro, што је значајно проширило могућности за проучавање процеса полагања примарних ткива и органа, њихове диференцијације и ембрионалне органогенезе.

Јасно је утврђено да се in vivo током ембриогенезе ембрионалне створе (ЕСС) интегришу у ћелијску масу раног ембриона, а њихови деривати се налазе у свим органима и ткивима. ЕСС колонизују линију герминативних ћелија у химерном ембриону, чији потомци формирају пуноправне јајне ћелије и сперматозоиде. Ембрионалне матичне ћелије су клоногене - једна ЕСС је способна да створи генетски идентичну колонију ћелија са молекуларним маркерима, који укључују експресију гена oct4 и алкалне фосфатазе, високу активност теломеразе и експресију одређених ембрионалних антигена.

Да би се проучили механизми ембриогенезе коришћењем ЕСЦ, развијена је метода химеризације моруле стварањем биолошке конструкције, изван које се налази слој тетраплоидних бластомера реципијента, а унутра се уносе ЕСЦ донора. Тако се трофобласт формира од потомака тетраплоидних бластомера реципијента, што обезбеђује имплантацију и плацентацију, а ЕСЦ донора делују као унутрашња ћелијска маса из које се формира тело одрживог ембриона и линија примарних прогениторских герминативних ћелија. Истраживачка вредност ЕСЦ не лежи само у чињеници да се плурипотентност очува током ин витро манипулација са њиховим геномом, већ и у чињеници да се очува способност ЕСЦ да учествују у формирању примарних герминативних ћелија химерног ембриона. Показано је да потомци само једне генетски модификоване ЕСЦ насељавају све примарне зачетке и ткива у развоју химерног ембриона добијеног агрегацијом или кокултивацијом ове ћелије са ембрионом од 8 ћелија. Када су ЕСК трансфектоване геном зеленог флуоресцентног протеина трансплантиране у морулу мишева, флуоресцентни потомци ове ћелије пронађени су у свим проучаваним ткивима ембриона у развоју (Shimada, 1999). Трансплантација ЕСК у морулу омогућава стварање одрживих мишева чији се организам састоји само од потомака донорског ЕСК-а, што отвара перспективе за различите опције за терапијско клонирање. Овај методолошки приступ се сада успешно користи за проучавање проблема развојне биологије, посебно се користи за анализу механизама генетске инактивације X хромозома или епигенетске нестабилности ЕСК-а. Трансплантација ЕСК-а у рани ембрион се такође користи у пољопривредној биотехнологији, као и у експериментима генске терапије.

Трансплантација генетски модификованих ЕСК се користи за тестирање циљних ћелија мутантних гена. ЕСК култивисане ин витро се користе у биотехнологији за стварање нокаут мишева. У ту сврху, ген који се проучава се уклања из ЕСК хомологном рекомбинацијом (нокаутом) и ћелије којима недостаје овај ген се изолују на селективним медијумима. Нокаут ЕСК се затим уносе у бластоцисту или агрегирају са бластомерима моруле. Химерни рани ембриони добијени на овај начин се трансплантирају у женке примаоце, а јединке са гаметима нулизиготним за дати ген се бирају из новорођених мишева. Ова технологија је коришћена за стварање многих линија нокаут мишева, који се широко користе у експерименталној биологији и експерименталној медицини. Такви биолошки модели се користе за проучавање значаја одређених гена у ембрионалном развоју, као и њихове улоге у механизмима људских болести и патолошких стања. Поред тога, нокаут животињске линије се користе у преклиничком тестирању нових метода генске терапије. На пример, трансфекцијом нормалног алела мутантног гена у геном ЕСК, могуће је ефикасно исправити мутацију која утиче на хематопоетски систем. Уношење страних гена у ЕСК омогућава брзо стварање линија хомозиготних трансгених лабораторијских животиња. Међутим, треба напоменути да је техника циљане рекомбинационе делеције гена до сада поуздано развијена само у односу на ЕСК миша. Коришћењем двоструко нокаутираних ЕСК миша утврђена је функционална улога региона генског кластера на хромозому 7 (копија геномског региона на људском хромозому 19) и проксималног региона хромозома 11 (копија људског хромозома 5g) - делеција ових гена у ЕСК миша омогућила је процену функције њихових аналога код људи.

Могућности проучавања функције гена људске ембриогенезе су се прошириле, чија је трансфекција у геном ЕСК лабораторијских животиња омогућила, посебно, да се разјасни улога крипто гена у формирању и развоју кардиогеног мезодерма, гена pax-6 - у ембриогенези ока. Састављају се прве мапе експресије гена у незрелим пролиферирајућим ЕСК тератокарцинома и бластоциста мишева, а потврђена је и супресивна репресија транссигналних гена у ЕСК. Комбинација 60-80 мутантних ЕСК и 20-30 ћелија нормалних преимплантационих мишјих ембриона доводи до развоја химерних ембриона у којима се органски зачеци састоје од донорских и реципијентних ћелија, што омогућава разјашњење улоге непознатих гена у гаструлацији и органогенези. Функционална мапа гена мишјих ембриона у развоју допуњена је информацијама о улози гена sf-1 у формирању надбубрежне жлезде и гонада, гена wt-1 у формирању бубрега, гена породице myoD у формирању скелетних мишића и гена породице gata-1-4 у рестрикционом сазревању рудимента еритропоезе и лимфопоезе.

Усмерено искључивање мајчинских и очевих алела гена у ЕСЦ коришћењем векторских рекомбиназа омогућило је разјашњење функција различитих гена у раном периоду ембриогенезе, а технологија усмереног преноса непознатих људских гена у мишје ЕСЦ доприноси откривању нових мутантних гена одговорних за развој тешке наследне патологије. Коришћењем методе нокаута утврђен је обавезни значај неких гена за формирање ембрионалних ткива: gata-4 - за миокардијум, gata-1 - за еритроидну линију хематопоетског ткива, myoD - за скелетне мишиће, brachyury - за мезодерм, рестрикционе транскриптазе hnf3 и hnf4 - за матичне ћелије јетре, rag-2 - за формирање Т- и Б-лимфоцитних клонова (Repin, 2001). Двострука делеција гена у ЕСЦ отворила је приступ проучавању функционалне улоге гена клициног слоја, сегментације и хомеозе, а трансплантација ЕСЦ омогућила је добијање одрживих међуврсних хибридних ембриона. Коришћењем побољшане технике трансплантације ЕСЦ једног донора у ембрион од 8 ћелија, доказана је чињеница химеризације на ћелијском нивоу многих органа ембриона примаоца. Треба напоменути да су ћелијски клице људског ткива пронађене у органима мишева примаоца након уношења људских хематопоетских матичних ћелија у бластоцисту. Утврђено је да плурипотентне ЕСЦ циркулишу у крви мишјих ембриона током периода формирања органа. Могуће је да њихова биолошка функција лежи у ембрионалној организацији будућег имуног система. Уз помоћ ЕСЦ, у лабораторијским условима су репродуковани адекватни модели људске генетске патологије: двоструки нокаут гена дистрофина моделира Душенову мишићну дистрофију код мишева, и гашење гена atm (контрола синтезе хроматин сигналне киназе) - атаксија-телангектазија. Код ове фаталне наследне болести код деце, дегенерација Пуркињеових ћелија у малом мозгу развија се услед дефекта у репарацији ДНК, што је праћено инволуцијом тимуса услед смрти ћелија које се пролиферирају. Клиничка слика, патофизиологија и патоморфологија атаксије-телангектазије, репродуковане уношењем патолошких генетских информација у ЕСК, код химерних мишева одговарају онима код људи. Поред атаксије-телангектазије, коришћењем ЕСК и нокаут мишева, развијени су експериментални модели неких наследних хомозиготних људских болести повезаних са патологијом метаболизма угљених хидрата и липида, катаболизмом аминокиселина и излучивањем бакра и билирубина, што је значајно проширило могућности експерименталне медицине у фази преклиничког испитивања нових метода за лечење одговарајућих људских болести.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Употреба цитохибрида матичних ћелија

Хибридне ћелије добијене спајањем ЕСЦ са соматским ћелијама су адекватан и перспективан модел за проучавање плурипотентности матичних ћелија и репрограмирање хромозома диференцираних ћелија. Цитохибриди добијени спајањем ЕСЦ са диференцираним ћелијама одрасле животиње омогућавају проучавање односа између генома различите „старости“: јединствена ситуација настаје када се хомологни хромозоми који потичу из ћелија у различитим фазама диференцијације и различитом степену зрелости налазе у истом једру, где могу лако размењивати транс-активне регулаторне сигнале. Тешко је предвидети како ће цисрегулаторни епигенетски системи хомологних хромозома, формирани током индивидуалног развоја, реаговати на утицај транс-активних сигнала који потичу из ембрионално сродних генома. Поред тога, у хибридним ћелијама се јавља сегрегација родитељских хромозома, што нам омогућава да проучавамо интеракцију генома на нивоу појединачних хромозома, односно да потенцијално идентификујемо учешће специфичних хромозома у одржавању плурипотентности или, обрнуто, излазу у диференцијацију.

Цитохибриди добијени спајањем плурипотентних тератокарциномских и диференцираних соматских ћелија коришћени су као први експериментални модел за проучавање интеракције генома са различитим „развојним историјама“. У неким случајевима, такве хибридне ћелије су задржале плурипотентна својства на прилично високом нивоу. Конкретно, in vivo хибридне ћелије тератокарцинома и соматских ћелија су индуковале развој правих тератома који садрже деривате сва три клицина слоја, а in vitro у суспензионим културама су формирале ембриоидна тела. Чак и код интерспецифичних цитохибрида овог типа, присуство ембрионалних антигена је примећено у случајевима где су соматски партнери у фузији са ћелијама тератокарцинома били лимфоцити или тимоцити. Важно је напоменути да су цитохибриди настали спајањем ћелија тератокарцинома са фибробластима одговарали фибробластима по фенотипу.

Најважнија утврђена чињеница је да су се у хибридним ћелијама тератокарцинома-соматског типа појавили знаци репрограмирања диференцираног ћелијског генома, што је окарактерисано реактивацијом или појединачних гена или неактивног X хромозома соматског партнера. Дакле, резултати студија на цитохибридима ћелијског типа тератокарцинома-соматског типа указују на то да је плурипотентност често очувана у хибридним ћелијама и да постоје знаци репрограмирања генома соматског партнера.

У експериментима добијања интраспецифичних ембрионалних хибридних ћелија спајањем мишјих ембрионалних ћелија са одраслим спленоцитима, проучаване су карактеристике таквих цитохибрида, анализирана је сегрегација родитељских хромозома и процењена је плурипотентност хибридног генома. Интраспецифични хибридни ћелија добијени спајањем ћелија тератокарцинома са соматским ћелијама обично се карактеришу ниским нивоом сегрегације хромозома са тетраплоидним или скоро тетраплоидним кариотипом. Сличан хромозомски састав је примећен код цитохибрида током спајања примарних герминативних ћелија са лимфоцитима. Истовремено, интерспецифични хибридни ћелија добијени спајањем ћелија тератокарцинома миша са лимфоцитима кунце показале су интензивну сегрегацију хромозома соматског партнера.

Квалитативно нова фаза у проучавању сегрегације родитељских хромозома код интраспецифичних хибрида започела је након развоја методе за анализу микросателита коришћењем полимеразне ланчане реакције, захваљујући којој је пронађено неколико стотина маркера за сваки мишји хромозом, омогућавајући поуздану дискриминацију било ког пара хомологних хромозома у хибридним ћелијама.

Фузијом ЕСЦ (ХМ-1 ћелије са дефицитом активности хипоксантин фосфорибозилтрансферазе, 2n = 40, XY, изоловане из бластоциста 129/01a мишева) са спленоцитима конгеничних DD/c мишева, било је могуће добити скуп хибридних клонова морфолошки сличних ЕСЦ. Сви клонови су изоловани на селективној подлози у којој могу да расту само ћелије са активном хипоксантин фосфорибозилтрансферазом. Електрофоретска анализа је показала да сви клонови имају алелну варијанту хипоксантин фосфорибозилтрансферазе карактеристичну за DD/c мишеве. Цитогенетска анализа је показала да три од четири хибридна клона имају скоро диплоидан сет хромозома. Један скоро тетраплоидни клон садржао је две популације хибридних ћелија, од којих је једна била тетраплоидна, а друга, мања, диплоидна.

Микросателитска анализа, која омогућава дискриминацију било ког пара хомологних хромозома мишева 129/01a и DD/c, код хибридних клонова са скоро диплоидним скупом показала је да је код два клона постојала јасна преференцијална елиминација аутозома соматског партнера. Већина аутозома у клоновима HESS2 и HESS3 имала је маркере линије 129/01a, тј. плурипотентног партнера. Изузетак су били хромозоми 1 и I: у клоновима HESS2 и HESS3, заједно са маркерима HM-1 ћелија, маркери соматског партнера били су присутни у малим количинама. Такви резултати могу одражавати непотпуну сегрегацију хромозома 1 и I соматског партнера и у складу су са цитогенетским подацима да се трисомија за ове хромозоме примећује код 30-40% ћелија клонова HESS2 и HESS3. Клон HESS4 се значајно разликовао у свом хромозомском саставу: многи аутозоми у овом клону потичу из ESC генома (хромозоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), али хромозоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 и 19 су представљени хомолозима оба родитеља. Квантитативни однос микросателита који обележавају ове хомологне хромозоме био је приближно 1:1. Ово је омогућило ауторима да претпоставе да један хомолог потиче из ESC генома, а други из диференцираних ћелија. У неким субклоновима клона HESS4, били су присутни само маркери хромозома 18 и 19 соматског партнера. Добијени резултати указују да је у ћелијама HESS4 клона, поред сегрегације хромозома соматског партнера, дошло до елиминације једног или оба хомолога горе наведених хромозома плурипотентног генома, односно дошло је до билатералне сегрегације хромозома оба родитеља - веома неуобичајена појава, будући да је сегрегација хромозома само једног од родитеља карактеристична за цитохибриде.

Поред тога, након 20. пасажа, сви клонови хибридних ћелија садржали су само маркере X хромозома соматског партнера, тј. ESC X хромозом је у клоновима замењен X хромозомом соматског партнера. Ову важну чињеницу потврђују подаци in situ хибридизације коришћењем FITC-обележене сонде специфичне за X хромозом миша: позитиван сигнал је детектован само на једном хромозому. Треба напоменути да су у ранијим фазама култивације (пре 15. пасажа), према цитогенетским подацима, многе ћелије садржале два X хромозома. Стога, употреба селективних медијума омогућава манипулацију хромозомским саставом хибридних ћелија и селективну селекцију клонова који носе појединачне хромозоме соматског партнера на позадини ESC генома.

Пошто је јединствена карактеристика цитохибридног генома локализација родитељских генома у једном једру, природно се поставља питање очувања плурипотентних својстава ембрионалног генома код хибрида ЕСЦ-соматских ћелија под условима његовог блиског контакта са геномом диференциране ћелије. Морфолошки, цитохибриди ЕСЦ и соматских ћелија били су слични родитељској ЕСЦ линији. Евалуација плурипотентности показала је да су сви клонови са скоро диплоидним скупом хромозома способни да формирају ембриоидна тела у суспензионим културама, у којима су присутни деривати три клицина слоја.

Већина хибридних ћелија садржала је антиген ECMA-7, маркер карактеристичан за ране мишје ембрионе, а такође је имала високу активност алкалне фосфатазе. Најубедљивији подаци о високим плурипотентним својствима хибридних ћелија добијени су у експериментима добијања серије ињекционих химера које укључују хибридне ћелије HESS2 клона. Анализа биохемијских маркера показала је да су потомци донорских хибридних ћелија присутни у већини ткива химера. Стога, хибридне ћелије добијене спајањем ембрионских ћелија ћелија (ESC) и соматски диференцираних ћелија задржавају плурипотентност на високом нивоу, укључујући способност формирања химера када се ињектирају у шупљину бластоцисте.

Клонови HESS2 и HESS4 су се значајно разликовали у саставу родитељских хромозома, али су имали слична плурипотентна својства. Могло би се претпоставити да се плурипотентност у хибридном геному манифестује као доминантна особина, али је могуће да нису сви хромозоми ембрионалног генома укључени у процес одржавања плурипотентности. Ако је ова претпоставка тачна, онда се може очекивати да елиминација неких хромозома плурипотентног партнера из генома хибридних ћелија неће бити праћена променом њиховог плурипотентног статуса. У овом случају, анализа сегрегације родитељских хромозома у ембрионалним хибридним ћелијама би нам омогућила да се што боље приближимо идентификацији хромозома одговорних за контролу плурипотентности ембрионалних ћелија.

О. Серов и др. (2001) нису пронашли потомке међу 50 потомака добијених укрштањем химера са нормалним мишевима који су имали генотип миша 129/01a и носили X хромозом DD мишева. Аутори сматрају да је то последица смањења плурипотентности у хибридним ћелијама под утицајем соматског генома. Алтернативно објашњење може бити негативан ефекат трисомије на неке аутозоме и неравнотежа полних хромозома (XXY су примећени у ћелијама до 15. пасажа) у хибридним ћелијама током мејозе. Познато је да XXY ћелије нису у стању да прођу кроз мејозу и формирају гамете. Трисомија такође може изазвати смањење пролиферативне активности хибридних ћелија, услед чега селективна предност у развоју химера може припадати ћелијама ембриона примаоца. Из тога следи да је за адекватну процену плурипотентног потенцијала хибридних ћелија неопходно добити хибридне клонове са нормалним диплоидним скупом хромозома.

У експериментима О. Серова и коаутора (2001), први пут је демонстрирана могућност репрограмирања X хромозома соматске ћелије у геному хибридних ћелија. Овај закључак аутора произилази из анализе експресије гена hprt (маркер X хромозома) код химера: присуство алелне варијанте hprt мишева DD/c је детектовано у свим анализираним химерним ткивима. Прикладно је нагласити да након уношења хибридних ћелија у шупљину бластоцисте, цитохибриди падају у неселективне услове и очување X хромозома у геному хибридних ћелија значи да је он постао њена облигатна компонента и геном га не разликује од Y хромозома плурипотентног партнера.

Сумирајући резултате анализе интеракције соматских и плурипотентних генома у хибридним ембрионалним ћелијама, аутори закључују да се код неких цитохибрида плурипотентност манифестује као доминантна особина. Хибридни геном је способан да репрограмира појединачне хромозоме диференцираних ћелија, што, међутим, не искључује могућност обрнутог дејства соматског генома на плурипотентност ембрионалног генома. Приликом култивације хибридних ћелија, индукција диференцијације се јавља знатно чешће него у оригиналној родитељској линији ЕСК ХМ-1. Сличан ефекат се примећује током формирања примарних колонија: многе примарне колоније ембрионалних хибридних ћелија се диференцирају у раним фазама формирања са великим губицима клонова током њихове селекције и репродукције.

Дакле, цитохибриди настали фузијом ембрионалних ћелија (ЕСЦ) са соматским ћелијама, упркос блиском контакту са геномом диференцираних ћелија, задржавају плурипотентност као јединствено својство ембрионалног генома. Штавише, у таквим хибридним ћелијама је могуће репрограмирање појединачних хромозома који потичу из диференцираних ћелија. Остаје нејасно у којој мери се плурипотентна својства ембрионалног генома задржавају у хибридним ћелијама, посебно њихова способност да учествују у формирању герминативне линије код химера. Ово захтева добијање ембрионалних хибридних ћелија са нормалним кариотипом. У сваком случају, плурипотентне ембрионалне хибридне ћелије могу постати прави генетски модел за идентификацију хромозома укључених у одржавање плурипотентности или њену контролу, будући да билатерална сегрегација родитељских хромозома потенцијално пружа такву могућност.

Ништа мање атрактивно није проучавање феномена који О. Серов и др. (2001) дефинишу као „хромозомска меморија“. У хибридном геному, хомологни хромозоми се налазе у две алтернативне конфигурације: хомолози соматског партнера су једном прошли кроз диференцијацију, док код хомолога плурипотентног партнера овај процес тек почиње. Сходно томе, очување високих плурипотентних својстава од стране хибридних ћелија указује на то да је „плурипотентна“ конфигурација ЕСЦ хомолога довољно стабилна у хибридном геному, упркос утицају трансакцијских фактора који потичу од соматског партнера. Горе описани знаци репрограмирања хомологних хромозома диференцираног генома током развоја химера не искључују могућност да у првим фазама формирања и култивације цитохибрида in vitro они задржавају свој статус стечен током диференцијације in vivo. Према недавно добијеним подацима, када се ембрионалне хибридне ћелије пренесу у неселективно окружење, оне показују интензивну елиминацију хромозома само соматског партнера, тј. геном хибридних ћелија лако дискриминише хомологе након in vitro култивације током 10-15 пасажа. Дакле, ембрионалне хибридне ћелије представљају обећавајући експериментални модел за проучавање не само тако фундаменталног својства ембрионалног генома као што је плурипотентност, већ и његове алтернативе - ембрионалне диференцијације.

Терапеутска ефикасност трансплантације ембрионалних матичних ћелија

Пре анализе терапијске ефикасности трансплантације ЕСК и њихових деривата, сумирамо горе наведени материјал. Могућности ЕСК у смислу потпуне имплементације ембриогенезе in vitro су недовољне, јер су развојни дефекти у овом случају последица одсуства мезенхималних матичних ћелија, које настају у телу аутономно и независно од ЕСК. Генетски потенцијал ЕСК је мањи од генетског потенцијала зиготе, стога се ЕСК не користе директно за клонирање ембриона. Јединствени биолошки потенцијал ЕСК као јединих ћелија у којима су развојни програми у потпуности примењени у доследној имплементацији користи се у студијама функције гена. Уз помоћ ЕСК, декодирају се прве комбинације сигнала који активирају експресију раних и касних гена који кодирају развој три клицинa слоја. Очување плурипотентности генома ЕСК in vitro чини их јединственим алатом за репаративну регенерацију, способним да аутоматски надокнаде ћелијске губитке у случају оштећења органа и ткива. У идеалном хипотетичком сценарију, може се претпоставити да „... приликом трансплантације донорских ембрионалних ћелија (ESC), компактно упаковани програми се преносе у тело примаоца, који се, под повољним условима, реализују у изградњи новог ткива“7, способног „... да се ефикасно интегрише у тело примаоца и на морфолошком и на функционалном нивоу“.

Наравно, након развоја метода за монодиференцијацију ЕСЦ, започело је in vivo проучавање функционалне активности ћелија добијених in vitro из једног специјализованог клона. Пролиферирајући ЕСЦ клон генерише популације мигрирајућих прогениторских ћелија које су заиста способне да се активно интегришу у подручја оштећења ткива реципијента, што се користи у регенеративно-пластичној медицини. Утврђено је да трансплантација ДОПА неурона у супстанцију нигру смањује клиничке манифестације код експерименталног хемипаркинсонизма. Регионалне трансплантације донорских неуралних матичних ћелија смањују степен моторичких поремећаја изазваних траумом или контузијом кичмене мождине и мозга. Такође су добијени први позитивни резултати трансплантације матичних ћелија код демијелинизирајућих болести. Чини се да регенеративно-пластични потенцијал ЕСЦ отвара неограничене могућности за употребу ћелијске трансплантације у практичној медицини. Међутим, када се трансплантирају у ектопичне зоне, ЕСЦ неизбежно се трансформишу у туморе. Тератоми се формирају када се ЕСЦ убризгавају поткожно имунодефицијентним мишевима. Када се суспензије ЕСК трансплантирају испод капсуле тестиса код сингених мишева, такође се формирају тератоми, који се састоје од различитих ткива, чије су ћелије деривати сва три клицина слоја. Код таквих тератома, процеси смањене органогенезе су изузетно ретки.

Бројне студије пружају информације о позитивним резултатима трансплантације раних ЕСЦ деривата животињама са експерименталном патологијом. Ћелијска неуротрансплантација коришћењем ЕСЦ деривата се даље развија у експериментима и првим клиничким испитивањима за корекцију функционалних поремећаја код повреда мозга и кичме, и за лечење сирингомијелије и мултипле склерозе (Репин, 2001). Појавом технике ин витро неурогенезе из ЕСЦ, уместо коришћења ембрионалног можданог ткива, развијају се методе за трансплантацију деривата неуросфере добијених из ембрионалних култура нервног ткива. Такве суспензије трансплантата су знатно хомогеније и садрже посвећене прекурсоре неурона и неуроглије.

Редовним додавањем ретиноинске киселине у дози од 10 μг/мл у медијум за култивацију током 6 недеља, у линији људског ембрио-(терато)-карцинома NTERA-2 формира се више од 80% постмитотских неурона. Потпуна хомогеност неуронске популације постиже се сортирањем протока зрелих неурона обележених имунофенотипским маркерима, што омогућава уклањање остатака тератокарцинома и незрелих ћелија. Након трансплантације у различите регионе мозга експерименталних животиња, такви неурони не само да преживљавају, већ се и интегришу у регионалне неуронске мреже. Код животиња са експерименталним моделима локалних дефеката ЦНС-а, неуротрансплантација смањује клиничке манифестације таквих људских патологија као што су последице трауматске повреде мозга, можданог удара, демијелинизирајућих болести, наследних дефекта у развоју малог мозга, болести таложења липида и полисахарида.

Да би се оптимизовали процеси регенерације код дегенеративних болести централног нервног система, развијају се технологије за добијање олигодендроцита који производе мијелин из ембрионалних ћелија (ЕСЦ). Прва фаза традиционално обухвата пролиферацију ЕСЦ са репродукцијом броја ћелија потребног за трансплантацију. У другој фази се спроводи циљана диференцијација ћелија у популацију прекурсора олигодендроцита који производе мијелин, што се контролише селективним маркер антигенима.

Извесне перспективе се отварају за употребу деривата ЕСЦ за развој метода за корекцију имунодефицијенција изазваних генетским дефектима у сазревању тимуса. У студијама на нокаут (rag 1) мишевима са индукованим генским дефектом - поремећајем механизма рекомбинације V(D)J локуса TCR гена, што доводи до губитка функције Т-лимфоцита, трансплантација раних деривата ЕСЦ у тимус животиња обнавља сазревање нормалних популација имуних клонова одговорних за ћелијски имунитет. Клиничка испитивања трансплантације ин витро преформираних ЕСЦ за лечење фаталних наследних анемија код деце су у току.

Приговори на брзо увођење трансплантације матичних ћелија у клинику заснивају се на ограниченом броју стабилних линија људских ембрионалних матичних ћелија и потреби за њиховом стандардизацијом. Да би се повећала чистоћа стандардизованих ЕСЦ линија, као и одраслих људских матичних ћелија, предлаже се употреба методе селекције линија засноване на молекуларно-генетској анализи кратких тандемских ДНК понављања. Такође је потребно тестирати ЕСЦ линије на присуство малих хромозомских преуређења и генетских мутација, чији је потенцијал за појаву у условима ћелијске културе прилично висок. Износи се теза о обавезном тестирању својстава свих врста ЕСЦ и регионалних плурипотентних матичних ћелија, јер њихова репродукција in vitro може довести до појаве нових карактеристика које нису својствене ембрионалним матичним ћелијама или дефинитивним ткивима. Посебно се претпоставља да дуготрајна култивација у медијумима са цитокинима приближава ЕСЦ линије туморским ћелијама, јер оне пролазе кроз сличне промене у путевима регулације ћелијског циклуса са стицањем способности да изврше неограничен број ћелијских деоба. Неки аутори, на основу потенцијала за развој тумора, сматрају трансплантацију раних деривата ембрионалних матичних ћелија у људе непромишљеном. По њиховом мишљењу, много је безбедније користити посвећене потомке ЕСК, тј. линије диференцираних ћелијских прогенитора. Међутим, тренутно још увек није развијена поуздана техника за добијање стабилних људских ћелијских линија које се диференцирају у жељеном смеру.

Стога се у литератури појављује све више података о позитивном терапеутском ефекту трансплантације деривата људских ембрионалних матичних ћелија. Међутим, многе од ових студија се преиспитују и критикују. Неки истраживачи сматрају да су резултати раних клиничких испитивања прелиминарне природе и да само указују на то да су матичне ћелије способне да врше повољан ефекат на клинички ток одређене болести. Стога је неопходно добити податке о удаљеним резултатима трансплантације ћелија. Као аргумент се наводе фазе развоја клиничке неуротрансплантологије. Заиста, у почетку су у литератури преовладавале публикације о високој ефикасности трансплантације фрагмената ембрионалног мозга код Паркинсонове болести, али су се затим почели појављивати извештаји који негирају терапеутску ефикасност ембрионалног или феталног нервног ткива трансплантираног у мозак пацијената.

Прва клиничка испитивања су спроведена ради процене безбедности трансплантације неуробласта изведених из ЕСЦ тератокарцинома NTERA-2, чије су незреле ћелије биле подвргнуте пролиферацији у култури до акумулације масе од 100 милиона ћелија. Неке од ћелија добијених на овај начин коришћене су за карактеризацију фенотипа и одређивање ћелијских нечистоћа, као и за тестирање могуће контаминације вирусима и бактеријама. LIF и слој хранилица феталних стромалних ћелија су уклоњени из подлоге за култивацију, а створени су услови за циљану диференцијацију ЕСЦ у неуробласте коришћењем комбинације цитокина и фактора раста. Затим су неуробласти пречишћени из незрелих ћелија тератокарцинома на проточном ћелијском сортеру. Након секундарног пречишћавања и карактеризације фенотипа трансплантираних ћелија, суспензија неуробласта (10-12 милиона) је убризгана у базално једро мозга пацијената (у седмом месецу након хеморагичног можданог удара) коришћењем посебне микроканиле и шприца под стереотаксичном и компјутеризованом томографском контролом. Једногодишњи скрининг последица трансплантације неурона у зону можданог удара након трансплантације није открио никакве нежељене ефекте. Половина пацијената је показала побољшање моторичке функције у периоду од 6 до 12 месеци након трансплантације. Позитивне клиничке промене пратило је повећано снабдевање крвљу зоне можданог удара након трансплантације ћелија: просечно повећање апсорпције флуоресцентно обележене 2-деоксиглукозе, према позитронској емисионој томографији, достигло је 18%, а код неких пацијената - 35%.

Међутим, Национални институт за здравље САД спровео је независну студију о клиничкој ефикасности неуротрансплантације код пацијената са паркинсонизмом. Пацијентима у првој групи трансплантирани су делови ембрионалног нервног ткива који производе допамин, док је друга група пацијената подвргнута лажној операцији. Резултати указују на нулту клиничку ефикасност такве неуротрансплантације, упркос чињеници да су ембрионални неурони који производе допамин преживели у мозгу прималаца. Штавише, 2 године након трансплантације ембрионалног нервног ткива, 15% пацијената је развило перзистентну дискинезију, која је била одсутна код пацијената у плацебо групи (Матичне ћелије: научни напредак и будући правци истраживања. Нац. Институт за здравље. САД). Посматрања даљег развоја болести код ових пацијената су у току.

Неки аутори повезују контрадикторне податке из литературе о процени клиничке ефикасности неуротрансплантације са различитим приступима селекцији група пацијената, неадекватним избором метода за објективну процену њиховог стања и, што је најважније, различитим периодима развоја ембрионалног нервног ткива и различитим областима мозга из којих је ово ткиво добијено, различитим величинама трансплантата и методолошким карактеристикама хируршке интервенције.

Треба напоменути да су покушаји директне трансплантације плурипотентних ембрионалних матичних ћелија у стријатумски регион мозга пацова са експерименталним хемипаркинсонизмом били праћени пролиферацијом ЕСЦ и њиховом диференцијацијом у допаминергичке неуроне. Треба претпоставити да су новоформирани неурони ефикасно интегрисани у неуронске мреже, будући да је након трансплантације ЕСЦ примећена корекција аномалија у понашању и моторичке асиметрије у тесту са апоморфином. Истовремено, неке животиње су угинуле због трансформације трансплантираних ЕСЦ у туморе мозга.

Стручњаци из Националне и Медицинске академије САД, специјалисти из Националног института за здравље САД сматрају да клинички потенцијал ЕСЦ заслужује најозбиљнију пажњу, али инсистирају на потреби детаљног проучавања њихових својстава, вероватноће компликација и дугорочних последица у експериментима на адекватним биолошким моделима људских болести (Матичне ћелије и будућа регенеративна медицина Националне академије штампа; Матичне ћелије и будући правци истраживања. Нат. Институт здравља САД).

Са ове тачке гледишта, важно је да је упоредна хистолошка анализа експерименталних тератома добијених трансплантацијом суспензије ЕСК у тестис са тератомима насталим као резултат трансплантације раног ембриона, који такође садржи ЕСК, показала да ЕСК, без обзира на њихов извор порекла или интеракцију са одређеним околним ћелијама, реализују свој туморогени потенцијал на исти начин. Доказано је да такви тератоми имају клонално порекло, јер тумори који се састоје од деривата сва три клицинa слоја могу настати из једног ЕСК (Rega, 2001). Важно је напоменути да су, када су клониране ЕСК са нормалним кариотипом трансплантиране у имунодефицијентне мишеве, формирани и тератоми који се састоје од различитих типова диференцираних соматских ћелија. Ови експериментални подаци су беспрекоран доказ клоналног порекла тератома. Са становишта развојне биологије, они указују да не вишеструке посвећене прогениторске ћелије, већ једна плурипотентна матична ћелија делује као извор диференцираних деривата сва три клицинa слоја који чине тератом. Међутим, на путу ка практичној трансплантацији ћелија, резултати ових студија су, ако не и препрека, онда упозоравајући знак потенцијалне опасности, будући да инокулација ембрионалних ћелија (ЕСЦ) или примордијалних герминативних ћелија у различита ткива одраслих имунодефицијентних мишева неизбежно узрокује развој тумора из трансплантираних матичних ћелија. Неопластична дегенерација ектопично трансплантираних ЕСЦ праћена је појавом сателитских популација диференцираних ћелија - због делимичне диференцијације ЕСЦ и прогениторских клонова у специјализоване линије. Занимљиво је да се, када се ЕСЦ трансплантирају у скелетне мишиће, неурони најчешће формирају поред ћелија тератокарцинома. Међутим, уношење ЕСЦ у јајну ћелију која се дели или бластоцисту прати потпуна интеграција ћелија у ембрион без формирања неопластичних елемената. У овом случају, ЕСЦ се интегришу у практично све органе и ткива ембриона, укључујући и генитални примордијум. Такве алофен животиње су први пут добијене уношењем ћелија тератокарцинома 129 у ране ембрионе у фазама 8-100 ћелија. Код алофенских мишева, популације хетерогених ћелија изведених из донорских ембрионалних ћелија интегрисане су у ткива коштане сржи, црева, коже, јетре и гениталија, што омогућава стварање чак и међуврсних ћелијских химера у експерименту. Што је краћи период развоја раног ембриона, то је већи проценат ћелијске химеризације, при чему је највећи степен химеризације примећен у хематопоетском систему, кожи, нервном систему, јетри и танком цреву алофенског ембриона. Код одраслог организма, ткива заштићена од имуног система примаоца хистохематским баријерама подложна су химеризацији:Трансплантација примарних герминативних ћелија у паренхим тестиса праћена је уградњом донорских матичних ћелија у слој герминативног ткива примаоца. Међутим, приликом трансплантације ембрионалних ћелија (ESC) у бластоцисту, не долази до формирања химерних рудимента полних органа са генерисањем донорских примарних герминативних ћелија. Плурипотентност ESC, када се створе посебни услови, може се користити и за клонирање: трансплантација мишјих ESC у мишји ембрион од 8-16 ћелија, у коме су ћелијске митозе блокиране цитокалсином, промовише спровођење нормалне ембриогенезе са развојем ембриона из донорских ESC.

Стога, алтернатива алогеној трансплантацији ЕСЦ је терапијско клонирање засновано на трансплантацији језгара соматских ћелија у енуклеирану јајну ћелију ради стварања бластоцисте, из чије унутрашње ћелијске масе се затим изолују линије ЕСЦ генетски идентичне донору соматског једра. Технички, ова идеја је сасвим изводљива, будући да је могућност стварања ЕСЦ линија из бластоциста добијених након трансплантације соматских језгара у енуклеиране јајне ћелије више пута доказана у експериментима на лабораторијским животињама (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Конкретно, код мишева хомозиготних за мутацију гена rag2, фибробласти добијени култивацијом ћелија субепидермалног ткива коришћени су као донори језгара, која су трансплантирана у енуклеиране ооците. Након активације ооцита, „зигот“ је култивисан до формирања бластоцисте, из чије унутрашње ћелијске масе су изоловане ЕСЦ и пренете у линију ћелија нулизиготних за мутантни ген (rag2~/~). Мутација једног алелног гена је коригована у таквим ЕСЦ методом хомологне рекомбинације. У првој серији експеримената, ембриоидна тела су добијена из ЕСЦ са рекомбинантним рестаурираним геном, њихове ћелије су трансфектоване рекомбинантним ретровирусом (HoxB4i/GFP) и, након репродукције, убризгане су у вену rag2~/~ мишева. У другој серији, тетраплоидни бластомери су агрегирани са генетски модификованим ЕСЦ и трансплантирани у женке реципијенте. Добијени имунокомпетентни мишеви служили су као донори коштане сржи за трансплантацију у rag2~/~ мутантне мишеве. У обе серије резултат је био позитиван: након 3-4 недеље зреле нормалне мијелоидне и лимфоидне ћелије способне за производњу имуноглобулина пронађене су код свих мишева. Дакле, трансплантација језгара соматских ћелија у ооците може се користити не само за добијање ЕСЦ линија, већ и за цитогенотерапију - корекцију наследних аномалија, користећи ЕСЦ као вектор за транспорт корективних генетских информација. Али овај правац трансплантације ћелија, поред биоетичких проблема, има своја ограничења. Није јасно колико ће бити безбедна трансплантација терапеутски клонираних ћелија са генотипом идентичним генотипу одређеног пацијента, будући да такве ћелије могу увести мутације које стварају предиспозицију за друге болести. Нормалне људске јајне ћелије остају тешко доступан објекат, док чак и код трансплантације соматских језгара у енуклеирана животињска јајна ћелија, само 15-25% конструисаних „зигота“ се развија до стадијума бластоцисте. Још увек није утврђено колико је бластоциста потребно да би се добила једна линија плурипотентних клонираних ембрионалних ћелија (ЕМЦ). Такође је вредно напоменути висок ниво финансијских трошкова повезаних са сложеношћу методологије терапеутског клонирања.

У закључку, треба напоменути да је код ЕСЦ плурипотентност генома са хипометилованом ДНК комбинована са високом теломеразном активношћу и кратком C^ фазом ћелијског циклуса, што обезбеђује њихову интензивну и потенцијално бесконачну репродукцију, током које ЕСЦ задржавају диплоидни скуп хромозома и „јувенилни“ скуп фенотипских карактеристика. Клонски раст ЕСЦ у култури не омета њихову диференцијацију у било коју специјализовану ћелијску линију организма када се пролиферација заустави и додају одговарајући регулаторни сигнали. Рестрикциона диференцијација ЕСЦ у соматске ћелијске линије in vitro остварује се без учешћа мезенхима, заобилазећи Нохтеје, ван органогенезе и без формирања ембриона. Ектопично уношење ЕСЦ in vivo неизбежно доводи до формирања тератокарцинома. Трансплантација ЕСЦ у бластоцисту или рани ембрион праћена је њиховом интеграцијом са ембрионалним ткивима и стабилном химеризацијом његових органа.

Регенеративно-пластичне технологије засноване на трансплантацији ћелија су тачка пресека интересовања представника ћелијске биологије, развојне биологије, експерименталне генетике, имунологије, неурологије, кардиологије, хематологије и многих других грана експерименталне и практичне медицине. Најважнији резултати експерименталних студија доказују могућност репрограмирања матичних ћелија са циљаном променом њихових својстава, што отвара перспективе за контролу процеса цитодиференцијације коришћењем фактора раста - за регенерацију миокарда, рестаурацију лезија ЦНС-а и нормализацију функције острвског апарата панкреаса. Међутим, за широко увођење трансплантације деривата ЕСЦ у практичну медицину, неопходно је детаљније проучити својства људских матичних ћелија и наставити експерименте са ЕСЦ на експерименталним моделима болести.

Биоетичка питања и проблем одбацивања алогеног ћелијског трансплантата могли би се решити откривеном пластичношћу генома регионалних матичних ћелија одраслог организма. Међутим, почетна информација да се приликом трансплантације изолованих и пажљиво окарактерисаних хематопоетских аутологних ћелија у јетру, из којих настају нови хепатоцити, интегришући се у лобуле јетре, сада ревидира и критикује. Ипак, објављени су подаци да трансплантација неуралних матичних ћелија у тимус изазива формирање нових донорских Т- и Б-лимфоцитних клица, а трансплантација можданих неуралних матичних ћелија у коштану срж доводи до формирања хематопоетских клица са дугорочном донорском мијело- и еритропоезом. Сходно томе, плурипотентне матичне ћелије способне да репрограмирају геном у потенцијал ембрионалних ћелија могу перзистирати у органима одраслог организма.

Извор добијања ЕСК у медицинске сврхе остаје људски ембрион, што предодређује неизбежност новог пресека моралних, етичких, правних и религиозних питања у тачки настанка људског живота. Откриће ЕСК дало је снажан подстицај обнављању тешких дискусија о томе где је граница између живих ћелија и материје, бића и личности. Истовремено, не постоје универзалне норме, правила и закони у вези са употребом ЕСК у медицини, упркос вишеструким покушајима да се оне створе и усвоје. Свака држава, у оквиру свог законодавства, решава овај проблем самостално. Са своје стране, лекари широм света настављају да покушавају да регенеративно-пластичну медицину изведу ван оквира таквих дискусија, првенствено кроз коришћење резерви одраслих матичних ћелија, а не ембрионалних матичних ћелија.

Мало историје изолације ембрионалних матичних ћелија

Ћелије терато(ембрио)карцинома су изоловане из спонтано насталих тератома тестиса мишева 129/ter-Sv, спонтаних тератома јајника мишева Lt/Sv и из тератома изведених из ектопично трансплантираних ембрионалних ћелија или ткива. Међу стабилним ћелијским линијама терато(ембрио)карцинома мишева добијеним на овај начин, неке су биле плурипотентне, друге су се диференцирале само у један специфичан тип ћелија, а неке су биле потпуно неспособне за цитодиференцијацију.

У једном тренутку, фокус је био на студијама чији су резултати указивали на могућност враћања ћелија терато-(ембрио)-карцинома у нормалан фенотип након њиховог уношења у ткива ембриона у развоју, као и рад на стварању генетски модификованих ћелија терато-(ембрио)-карцинома in vitro, уз помоћ којих су добијени мутантни мишеви за биолошко моделирање људске наследне патологије.

Култивација у условљеној суспензији коришћена је за изолацију ћелијских линија терато-(ембрио)-карцинома. У култури, ћелије терато-(ембрио)-карцинома, попут ембрионалних ћелијских ћелија (ESC), расту и формирају ембриоидна тела и захтевају обавезну дисоцијацију за пренос линије, одржавајући плурипотентност на слоју хранилице ембрионалних фибробласта или током култивације у суспензији у условљеној подлози. Ћелије плурипотентних линија терато-(ембрио)-карцинома су велике, сферне, карактеришу их висока активност алкалне фосфатазе, формирају агрегате и способне су за вишесмерну диференцијацију. Када се унесу у бластоцисту, оне се агрегирају са морулом, што доводи до формирања химерних ембриона, у чијем саставу се налазе деривати ћелија терато-(ембрио)-карцинома. Међутим, огромна већина таквих химерних ембриона умире у материци, а у органима преживелих новорођених химера, стране ћелије се ретко детектују и у ниској су густини. Истовремено, учесталост тумора (фибросарком, рабдомиосарком, друге врсте малигних тумора и аденом панкреаса) нагло се повећава, а дегенерација тумора се често јавља током периода интраутериног развоја химерних ембриона.

Већина ћелија терато-(ембрио)-карцинома у микроокружењу нормалних ембрионалних ћелија готово природно стиче карактеристике малигних неопластичних болести. Верује се да је иреверзибилна малигност последица активације прото-онкогена у процесу структурних преуређења. Један од изузетака су ћелије линије ембриокарцинома SST3, добијене из тератома тестиса миша (линија 129/Sv-ter), које показују високу способност интеграције у ткива и органе ембриона без накнадног формирања тумора код химерних мишева. Деривати ћелијских линија терато-(ембрио)-карцинома код химерних мишева практично не учествују у формирању примарних гоноцита. Очигледно је да је то због високе учесталости хромозомских аберација карактеристичних за већину линија терато-(ембрио)-карцинома, у чијим ћелијама се примећују и анеуплоидија и хромозомске абнормалности.

У лабораторијским условима добијено је неколико стабилних линија ћелија људског терато-(ембрио)-карцинома, које карактерише плурипотенција, висока пролиферативна активност и способност диференцијације током раста у културама. Конкретно, линија ћелија људског терато-(ембрио)-карцинома NTERA-2 коришћена је за проучавање механизама неуралне цитодиференцијације. Након трансплантације ћелија ове линије у субвентрикуларни регион предњег мозга новорођених пацова, примећена је њихова миграција и неурогенеза. Чак су учињени покушаји трансплантације неурона добијених култивацијом ћелија линије терато-(ембрио)-карцинома NTERA-2 пацијентима са можданим ударом, што је, према речима аутора, довело до побољшања клиничког тока болести. Истовремено, није било случајева малигнитета трансплантираних ћелија линије терато-(ембрио)-карцинома NTERA-2 код пацијената са можданим ударом.

Прве линије недиференцираних плурипотентних мишјих ембрионалних матичних ћелија добијене су почетком 1980-их од стране Еванса и Мартина, који су их изоловали из унутрашње ћелијске масе бластоцисте - ембриобласта. Изоловане ЕСЦ линије су дуго задржавале плурипотентност и способност диференцијације у различите типове ћелија под утицајем фактора у посебној подлози за култивацију.

Сам термин „ембрионална плурипотентна матична ћелија“ припада Лероју Стивенсу, који је, проучавајући утицај дуванског катрана на учесталост развоја тумора, скренуо пажњу на спонтану појаву тератокарцинома тестиса код линеарних (129/v) мишева контролне групе. Ћелије тератокарцинома тестиса карактерисале су се високом стопом пролиферације, а у присуству течности из абдоминалне дупље спонтано су се диференцирале формирањем неурона, кератиноцита, хондроцита, кардиомиоцита, као и фрагмената длаке и костију, али без икаквих знакова уређене цитоархитектуре одговарајућег ткива. Када су стављене у културу, ћелије тератокарцинома су расле као плурипотентни клонови невезани за подлогу и формирале ембриоидна тела, након чега су престале да се деле и подвргле су се спонтаној неуређеној диференцијацији у неуроне, глију, мишићне ћелије и кардиомиоците. Стивенс је открио да тератокарцином миша 129/в садржи мање од 1% ћелија способних да се диференцирају у разне специјализоване соматске линије, а сама диференцијација зависи од фактора који на њих утичу (састав перитонеалне течности, производи зрелих ћелија или ткива додатих у културу). Хипотеза Лероја Стивенсона о присуству ембрионалних ћелија прогенитора герминативне линије међу ћелијама тератокарцинома је потврђена: суспензија ембриобластних ћелија из преимплантационих ембриона у ткивима одраслих мишева формирала је тератокарциноме, а чисте ћелијске линије изоловане из њих након интраперитонеалне примене животињама реципијентима диференцирале су се у неуроне, кардиомиоците и друге соматске ћелије изведене из сва три герминативна слоја. У in vivo експериментима, трансплантација ембрионских ћелија (добијених из ембриобласта, али не и трофобласта) у мишје ембрионе друге линије у фазама бластомера 8-32 резултирала је рађањем химерних животиња (без развоја тумора), у чијим органима су пронађени клице донорског ткива. Химеризам је примећен чак и у герминативној ћелијској линији.

Примарне прогениторске клицине ћелије изоловане из гениталног рудимента мишјег ембриона одговарале су по морфологији, имунолошком фенотипу и функционалним карактеристикама ембрионалним ћелијским ћелијама (ЕСЦ) које је Стивенсон добио из тератокарцинома и ембриобласта. Код химера рођених након што су ЕСЦ уведене у бластоцисту, алофенска морфогенеза органа карактерисала се мозаичном сменом донорских и реципијентних структурних и функционалних јединица јетре, плућа и бубрега. У неким случајевима примећено је формирање цревних крипти или лобула јетре који се састоје и од реципијентних и од донорских ћелија. Међутим, морфогенеза се увек реализовала према генетском програму врсте којој је реципијент припадао, а химеризам је био ограничен искључиво на ћелијски ниво.

Тада је утврђено да се пролиферација ембрионалних матичних ћелија (ЕМЦ) без цитодиференцијације на слоју хранилице ћелија изведених из мезенхима (фетални фибробласти) одвија уз обавезно присуство ЛИФ-а у селективним хранљивим медијумима, који селективно обезбеђују преживљавање само матичних и прогениторских ћелија, док огромна већина специјализованих ћелијских елемената угине. Користећи такве методе, Џејмс Томсон је 1998. године изоловао пет иммортализованих линија ембрионалних матичних ћелија из унутрашње ћелијске масе људске бластоцисте. Исте године, Џон Герхарт је развио метод за изоловање бесмртних ЕМЦ линија из гениталног туберкулуса људских ембриона старих четири до пет недеља. Због својих јединствених својстава, само две године касније, ембрионалне матичне ћелије и матичне ћелије дефинитивних ткива почеле су да се користе у пракси регенеративне медицине и генске терапије.