Хематопоетске матичне ћелије жуманчане кесе

Очигледно је да су различити пролиферативни и диференцијациони потенцијали хематопоетских матичних ћелија одређени особеностима њиховог онтогенетског развоја, будући да се чак и локализација главних области хематопоезе мења код људи током онтогенезе. Хематопоетске прогениторске ћелије феталне жуманчане кесе посвећене су формирању искључиво еритропоетичке ћелијске линије. Након миграције примарних ХСК у јетру и слезину, спектар линија посвећености се шири у микроокружењу ових органа. Конкретно, хематопоетске матичне ћелије стичу способност да генеришу ћелије лимфоидне лозе. У пренаталном периоду, хематопоетске прогениторске ћелије достижу зону коначне локализације и насељавају коштану срж. Током интраутериног развоја, фетална крв садржи значајан број хематопоетских матичних ћелија. На пример, у 13. недељи трудноће, ниво ХСК достиже 18% од укупног броја мононуклеарних крвних зрнаца. Након тога се примећује прогресивно смањење њиховог садржаја, али чак и пре рођења, количина ХСК у крви пупчане врпце се мало разликује од њихове количине у коштаној сржи.

Према класичним схватањима, природна промена локализације хематопоезе током ембрионалног развоја сисара спроводи се миграцијом и уношењем у ново микроокружење плурипотентних хематопоетских матичних ћелија - од жуманчане кесе до јетре, слезине и коштане сржи. Пошто у раним фазама ембрионалног развоја хематопоетско ткиво садржи велики број матичних ћелија, који се смањује како фетус сазрева, најперспективнијим за добијање хематопоетских матичних ћелија сматра се хематопоетско ткиво ембрионалне јетре, изоловано из абортираног материјала у 5-8 недељи гестације.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Питања о пореклу хематопоетских матичних ћелија

Нема сумње да ембрионално формирање еритроцита потиче из крвних острваца жуманчане кесе. Међутим, потенцијал диференцијације in vitro хематопоетских ћелија жуманчане кесе је веома ограничен (оне се диференцирају углавном у еритроците). Треба напоменути да трансплантација хематопоетских матичних ћелија жуманчане кесе није у стању да обнови хематопоезу дуго времена. Испоставило се да ове ћелије нису прекурсори одраслих ХСК. Праве ХСК се појављују раније, у 3.-5. недељи интраутериног развоја, у зони формирања желудачног ткива и ендотела крвних судова (парааортна спланхноплеура, П-СП), као и на месту аорте, гонада и примарних бубрега - у мезонефросу или такозваном АГМ региону. Показано је да су ћелије АГМ региона извор не само ХСК, већ и ендотелних ћелија крвних судова, као и остеокласта укључених у процесе формирања коштаног ткива. У 6. недељи гестације, ране хематопоетске прогениторске ћелије из АГМ региона селе се у јетру, која остаје главни хематопоетски орган фетуса до рођења.

Пошто је ова тачка изузетно важна са становишта трансплантације ћелија, проблем порекла ХСК у процесу људске ембриогенезе заслужује детаљније представљање. Класичне идеје да хематопоетске матичне ћелије сисара и птица потичу из екстраембрионалног извора засноване су на студијама Меткалфа и Мура, који су први користили методе клонирања ХСК и њихових потомака изолованих из жуманчане кесе. Резултати њиховог рада послужили су као основа за теорију миграције, према којој ХСК, након што се прво појавиле у жуманчаној кеси, секвенцијално насељавају пролазне и дефинитивне хематопоетске органе како се у њима формира одговарајуће микроокружење. Тако је успостављено гледиште да генерација ХСК, првобитно локализованих у жуманчаној кеси, служи као ћелијска основа за дефинитивну хематопоезу.

Хематопоетске прогениторске ћелије жуманчане кесе припадају категорији најранијих хематопоетских прогениторских ћелија. Њихов фенотип је описан формулом AA4.1+CD34+c-kit+. За разлику од зрелих ХСК коштане сржи, оне не експресују Sca-1 антигене и MHC молекуле. Чини се да појава маркер антигена на површинским мембранама ХСК жуманчане кесе током култивације одговара њиховој диференцијацији током ембрионалног развоја са формирањем посвећених хематопоетских линија: ниво експресије CD34 и Thy-1 антигена се смањује, експресија CD38 и CD45RA се повећава, а појављују се HLA-DR молекули. Са накнадном специјализацијом in vitro индукованом цитокинима и факторима раста, почиње експресија антигена специфичних за хематопоетске прогениторске ћелије одређене ћелијске линије. Међутим, резултати проучавања ембрионалне хематопоезе код представника три класе кичмењака (водоземци, птице и сисари) и, посебно, анализа порекла ХСК одговорних за дефинитивну хематопоезу у постнаталној онтогенези, противрече класичним концептима. Утврђено је да се код представника свих разматраних класа током ембриогенезе формирају два независна региона у којима настају ХСК. Екстраембрионални „класични“ регион је представљен жуманчаном кесом или њеним аналозима, док недавно идентификована интраембрионална зона локализације ХСК обухвата парааортни мезенхим и АГМ регион. Данас се може тврдити да код водоземаца и птица дефинитивне ХСК потичу из интраембрионалних извора, док се код сисара и људи учешће ХСК жуманчане кесе у дефинитивној хематопоези још увек не може у потпуности искључити.

Ембрионална хематопоеза у жуманчаној кеси је, заправо, примарна еритропоеза, која се карактерише очувањем једра у свим фазама сазревања еритроцита и синтезом хемоглобина феталног типа. Према најновијим подацима, талас примарне еритропоезе завршава се у жуманчаној кеси 8. дана ембрионалног развоја. Након тога следи период акумулације дефинитивних еритроидних ћелија прогенитора - BFU-E, које се формирају искључиво у жуманчаној кеси и први пут се појављују 9. дана гестације. У следећој фази ембриогенезе, дефинитивне еритроидне ћелије прогенитора - CFU-E, као и (!) мастоцити и CFU-GM су већ формиране. То је основа за гледиште да дефинитивне ћелије прогенитора настају у жуманчаној кеси, мигрирају крвотоком, таложе се у јетри и брзо покрећу прву фазу интраембрионалне хематопоезе. Према овим концептима, жуманчана кеса се може сматрати, с једне стране, местом примарне еритропоезе, а са друге стране, првим извором дефинитивних хематопоетских ћелија прогенитора у ембрионалном развоју.

Показано је да се ћелије које формирају колоније са високим пролиферативним потенцијалом могу изоловати из жуманчане кесе већ 8. дана гестације, тј. много пре затварања васкуларног система ембриона и жуманчане кесе. Штавише, ћелије са високим пролиферативним потенцијалом добијене из жуманчане кесе in vitro формирају колоније чија се величина и ћелијски састав не разликују од одговарајућих параметара културног раста матичних ћелија коштане сржи. Истовремено, приликом ретрансплантације ћелија жуманчане кесе које формирају колоније са високим пролиферативним потенцијалом, формира се знатно више ћелија-кћерки које формирају колоније и мултипотентних ћелија прогенитора него када се користе ћелије прогенитора хематопоезе коштане сржи.

Коначан закључак о улози хематопоетских матичних ћелија жуманчане кесе у дефинитивној хематопоези могли би се пружити резултатима рада у којем су аутори добили линију ендотелних ћелија жуманчане кесе (G166), која је ефикасно подржавала пролиферацију својих ћелија са фенотипским и функционалним карактеристикама HSC (AA4.1+WGA+, ниска густина и слаба адхезивна својства). Садржај ових последњих се повећао више од 100 пута када су култивисане на храњивом слоју ћелија C166 током 8 дана. Макрофаги, гранулоцити, мегакариоцити, бластне ћелије и моноцити, као и ћелије прекурсори Б- и Т-лимфоцита, идентификовани су у мешовитим колонијама узгајаним на подслоју ћелија C166. Ћелије жуманчане кесе које расту на подслоју ендотелних ћелија имале су способност саморепродукције и издржале су до три пасажа у експериментима аутора. Обнављање хематопоезе уз њихову помоћ код зрелих мишева са тешком комбинованом имунодефицијенцијом (СКИД) праћено је формирањем свих врста леукоцита, као и Т- и Б-лимфоцита. Међутим, аутори су у својим студијама користили ћелије жуманчане кесе ембриона старог 10 дана, код којих су екстра- и интраембрионални васкуларни системи већ затворени, што нам не дозвољава да искључимо присуство интраембрионалних ХСК међу ћелијама жуманчане кесе.

Истовремено, анализа потенцијала диференцијације хематопоетских ћелија раних фаза развоја, изолованих пре уједињења васкуларних система жуманчане кесе и ембриона (8-8,5 дана гестације), открила је присуство прекурсора Т- и Б-ћелија у жуманчаној кеси, али не и у телу ембриона. У ин витро систему, методом двостепене култивације на монослоју епителних и субепителних ћелија тимуса, мононуклеарне ћелије жуманчане кесе су се диференцирале у пре-Т- и зреле Т-лимфоците. Под истим условима култивације, али на монослоју стромалних ћелија јетре и коштане сржи, мононуклеарне ћелије жуманчане кесе су се диференцирале у пре-Б-ћелије и зреле IglVT-Б-лимфоците.

Резултати ових студија указују на могућност развоја ћелија имуног система из екстраембрионалног ткива жуманчане кесе, а формирање примарних Т- и Б-ћелијских линија зависи од фактора стромалног микроокружења ембрионалних хематопоетских органа.

Други аутори су такође показали да жуманчана кеса садржи ћелије са потенцијалом за лимфоидну диференцијацију, а резултујући лимфоцити се не разликују по антигеним карактеристикама од оних код полно зрелих животиња. Утврђено је да су ћелије жуманчане кесе ембриона старог 8-9 дана способне да обнове лимфопоезу у атимоцитном тимусу појавом зрелих CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцита који поседују формиран репертоар Т-ћелијских рецептора. Дакле, тимус може бити насељен ћелијама екстраембрионалног порекла, али је немогуће искључити вероватну миграцију раних ћелија прекурсора Т-лимфоцита из интраембрионалних извора лимфопоезе у тимус.

Истовремено, трансплантација хематопоетских ћелија жуманчане кесе одраслим озраченим примаоцима не резултира увек дугорочном репопулацијом зона локализације осиромашеног хематопоетског ткива, а ћелије жуманчане кесе in vitro формирају знатно мање слезинских колонија него ћелије AGM региона. У неким случајевима, користећи ћелије жуманчане кесе ембриона старог 9 дана, и даље је могуће постићи дугорочну (до 6 месеци) репопулацију хематопоетског ткива код озрачених прималаца. Аутори сматрају да се ћелије жуманчане кесе са CD34+c-kit+ фенотипом не само не разликују од оних из AGM региона по својој способности да репопулирају осиромашене хематопоетске органе, већ и ефикасније обнављају хематопоезу, будући да жуманчана кеса садржи скоро 37 пута више њих.

Треба напоменути да су у експериментима коришћене хематопоетске ћелије жуманчане кесе са маркер антигенима хематопоетских матичних ћелија (c-kit+ и/или CD34+ и CD38+), које су убризгане директно у јетру или абдоминалну вену потомства женки мишева које су примиле ињекцију бусулфана 18. дана трудноће. Код таквих новорођених животиња, сопствена мијелопоеза је била оштро потиснута због елиминације хематопоетских матичних ћелија изазване бусулфаном. Након трансплантације хематопоетских матичних ћелија жуманчане кесе, формирани елементи који садрже донорски маркер - глицерофосфат дехидрогеназу - детектовани су у периферној крви прималаца током 11 месеци. Утврђено је да ХСК жуманчане кесе обнављају садржај ћелија лимфоидне, мијелоидне и еритроидне лозе у крви, тимусу, слезини и коштаној сржи, а ниво химеризма је био већи у случају интрахепатичне него интравенске примене ћелија жуманчане кесе. Аутори сматрају да ћелије жуманчане кесе ембриона у раној фази (до 10 дана) захтевају прелиминарну интеракцију са хематопоетским микроокружењем јетре како би успешно населиле хематопоетске органе одраслих прималаца. Могуће је да постоји јединствена фаза развоја у ембриогенези, када ћелије жуманчане кесе, које првобитно мигрирају у јетру, затим стичу способност да насељавају строму хематопоетских органа зрелих прималаца.

У том смислу, треба напоменути да се химеризам ћелија имуног система прилично често примећује након трансплантације ћелија коштане сржи озраченим зрелим примаоцима - у крви потоњих, ћелије донорског фенотипа се налазе у прилично великим количинама међу Б-, Т-лимфоцитима и гранулоцитима примаоца, што се наставља најмање 6 месеци.

Хематопоетске ћелије код сисара се први пут детектују морфолошким методама 7. дана ембрионалног развоја и представљене су хематопоетским острвцима унутар крвних судова жуманчане кесе. Међутим, природна хематопоетска диференцијација у жуманчаној кеси ограничена је на примарне еритроците који задржавају језгра и синтетишу фетални хемоглобин. Ипак, традиционално се веровало да жуманчана кеса служи као једини извор ХСК које мигрирају у хематопоетске органе ембриона у развоју и обезбеђују дефинитивну хематопоезу код одраслих животиња, пошто се појава ХСК у телу ембриона поклапа са затварањем васкуларних система жуманчане кесе и ембриона. Ово гледиште поткрепљују подаци да ћелије жуманчане кесе, када се клонирају in vitro, дају гранулоците и макрофаге, а in vivo - слезинске колоније. Затим је, током експеримената трансплантације, утврђено да хематопоетске ћелије жуманчане кесе, које су у самој жуманчаној кеси способне да се диференцирају само у примарне еритроците, у микроокружењу јетре новорођених и одраслих SCID мишева, осиромашеног тимуса или стромалног храниоца, стичу способност репопулације хематопоетских органа са обнављањем свих хематопоетских линија чак и код одраслих животиња реципијената. У принципу, ово нам омогућава да их класификујемо као праве HSC - као ћелије које функционишу у постнаталном периоду. Претпоставља се да жуманчана кеса, заједно са AGM регионом, служи као извор HSC за дефинитивну хематопоезу код сисара, али њихов допринос развоју хематопоетског система још увек није јасан. Биолошко значење постојања два хематопоетска органа са сличним функцијама у раној ембриогенези сисара такође није јасно.

Потрага за одговорима на ова питања се наставља. Ин виво је било могуће доказати присуство у жуманчаној кеси ембриона старих 8-8,5 дана ћелија које обнављају лимфопоезу код сублетално озрачених SCID мишева са израженим недостатком Т- и Б-лимфоцита. Хематопоетске ћелије жуманчане кесе су убризгане и интраперитонеално и директно у ткиво слезине и јетре. Након 16 недеља, код прималаца су детектовани TCR/CD34 CD4+ и CD8+ Т-лимфоцити и B-220+IgM+ Б-лимфоцити обележени донорским MHC антрхгенима. Истовремено, аутори нису пронашли матичне ћелије способне за такво обнављање имуног система у телу ембриона старих 8-8,5 дана.

Хематопоетске ћелије жуманчане кесе имају висок пролиферативни потенцијал и способне су за продужено саморазмножавање in vitro. Неки аутори идентификују ове ћелије као ХСК на основу продуженог (скоро 7 месеци) стварања еритроидних прогениторских ћелија, које се разликују од ћелија-прогенитора коштане сржи еритроидне лозе по дужем периоду пасажирања, већим величинама колонија, повећаној осетљивости на факторе раста и дужој пролиферацији. Поред тога, под одговарајућим условима култивације ћелија жуманчане кесе in vitro, формирају се и лимфоидне прогениторске ћелије.

Приказани подаци нам генерално омогућавају да жуманчану кесу сматрамо извором ХСК, мање ангажованих и стога поседују већи пролиферативни потенцијал од матичних ћелија коштане сржи. Међутим, упркос чињеници да жуманчана кеса садржи плурипотентне хематопоетске прогениторске ћелије које одржавају различите линије хематопоетске диференцијације in vitro током дужег времена, једини критеријум за потпуност ХСК је њихова способност дугорочне репопулације хематопоетских органа примаоца, чије су хематопоетске ћелије уништене или генетски дефектне. Стога је кључно питање да ли плурипотентне хематопоетске ћелије жуманчане кесе могу мигрирати и насељавати хематопоетске органе и да ли је препоручљиво ревидирати познате радове који показују њихову способност репопулације хематопоетских органа зрелих животиња са формирањем главних хематопоетских линија. Интраембрионални извори дефинитивних ГСК идентификовани су код ембриона птица још седамдесетих година прошлог века, што је већ тада довело до сумње у устаљене идеје о екстраембрионалном пореклу ГСК, укључујући и код представника других класа кичмењака. У последњих неколико година појавиле су се публикације о присуству сличних интраембрионалних подручја која садрже ГСК код сисара и људи.

Треба још једном напоменути да је фундаментално знање у овој области изузетно важно за практичну трансплантацију ћелија, јер ће помоћи не само да се одреди преферирани извор ХСК, већ и да се утврде карактеристике интеракције примарних хематопоетских ћелија са генетски страним организмом. Познато је да уношење хематопоетских матичних ћелија јетре људског фетуса у ембрион овце у фази органогенезе доводи до рађања химерних животиња, у чијој крви и коштаној сржи је стабилно одређено 3 до 5% људских хематопоетских ћелија. Истовремено, људске ХСК не мењају свој кариотип, одржавајући високу стопу пролиферације и способност диференцијације. Поред тога, трансплантиране ксеногене ХСК не долазе у сукоб са имуним системом и фагоцитима организма домаћина и не трансформишу се у туморске ћелије, што је послужило као основа за интензиван развој метода за интраутерину корекцију наследне генетске патологије коришћењем ХСК или ЕСК трансфектованих дефицитарним генима.

Али у којој фази ембриогенезе је прикладније спровести такву корекцију? По први пут, ћелије одређене за хематопоезу појављују се код сисара одмах након имплантације (6. дан гестације), када су морфолошки знаци хематопоетске диференцијације и претпостављени хематопоетски органи још увек одсутни. У овој фази, дисперговане ћелије мишјег ембриона су способне да поново насељавају хематопоетске органе озрачених прималаца са формирањем еритроцита и лимфоцита који се разликују од ћелија домаћина по типу хемоглобина, односно глицерофосфат изомеразе, као и додатног хромозомског маркера (Tb) донорских ћелија. Код сисара, као и код птица, истовремено са жуманчаном кесом, пре затварања заједничког васкуларног корита, хематопоетске ћелије се појављују директно у телу ембриона у парааортној спланхноплеури. Хематопоетске ћелије фенотипа AA4.1+ су изоловане из AGM региона и окарактерисане као мултипотентне хематопоетске ћелије које формирају Т- и Б-лимфоците, гранулоците, мегакариоците и макрофаге. Фенотипски, ове мултипотентне прогениторске ћелије су веома блиске HSC ћелијама коштане сржи одраслих животиња (CD34+c-kit+). Број мултипотентних AA4.1+ ћелија међу свим ћелијама AGM региона је мали - чине не више од 1/12 његовог дела.

У људском ембриону је такође идентификован интраембрионални регион који садржи ХСЦ хомологне АГМ региону животиња. Штавише, код људи се више од 80% мултипотентних ћелија са високим пролиферативним потенцијалом налази у телу ембриона, иако су такве ћелије присутне и у жуманчаној кеси. Детаљна анализа њихове локализације показала је да су стотине таквих ћелија сакупљене у компактним групама које се налазе у непосредној близини ендотела вентралног зида дорзалне аорте. Фенотипски, то су CD34CD45+Lin ћелије. Напротив, у жуманчаној кеси, као и у другим хематопоетским органима ембриона (јетра, коштана срж), такве ћелије су појединачне.

Сходно томе, у људском ембриону, АГМ регион садржи кластере хематопоетских ћелија уско повезаних са вентралним ендотелом дорзалне аорте. Овај контакт се такође прати на имунохемијском нивоу - и ћелије хематопоетских кластера и ендотелне ћелије експресују васкуларни ендотелни фактор раста, Flt-3 лиганд, њихове рецепторе FLK-1 и STK-1, као и транскрипциони фактор леукемијских матичних ћелија. У АГМ региону, мезенхималне деривате представља густи ланац заобљених ћелија који се налази дуж целе дорзалне аорте и експресује тенасцин Ц - гликопротеин основне супстанце који активно учествује у процесима међућелијске интеракције и миграције.

Мултипотентне матичне ћелије АГМ региона након трансплантације брзо обнављају хематопоезу код зрелих озрачених мишева и обезбеђују ефикасну хематопоезу током дужег времена (до 8 месеци). Аутори нису пронашли ћелије са таквим својствима у жуманчаној кеси. Резултате ове студије потврђују подаци другог рада, који је показао да је код ембриона раних фаза развоја (10,5 дана) АГМ регион једини извор ћелија које одговарају дефиницији ХСЦ, обнављајући мијелоидну и лимфоидну хематопоезу код зрелих озрачених прималаца.

Стромална линија AGM-S3 је изолована из AGM региона, чије ћелије подржавају генерисање посвећених прогениторских ћелија CFU-GM, BFU-E, CFU-E и јединица које формирају колоније мешовитог типа у култури. Садржај ових последњих током култивације на храњивом подслоју ћелија AGM-S3 линије повећава се од 10 до 80 пута. Дакле, микроокружење AGM региона садржи базне ћелије строме које ефикасно подржавају хематопоезу, тако да сам AGM регион може деловати као ембрионални хематопоетски орган - извор дефинитивних HSC, односно HSC које формирају хематопоетско ткиво одрасле животиње.

Проширено имунофенотипизовање ћелијског састава АГМ региона показало је да он садржи не само мултипотентне хематопоетске ћелије, већ и ћелије посвећене мијелоидној и лимфоидној (Т- и Б-лимфоцити) диференцијацији. Међутим, молекуларна анализа појединачних CD34+c-kit+ ћелија из АГМ региона коришћењем полимеразне ланчане реакције открила је активацију само гена бета-глобина и мијелопероксидазе, али не и лимфоидних гена који кодирају синтезу CD34, Thy-1 и 15. Делимична активација гена специфичних за лозу карактеристична је за ране онтогенетске фазе генерације ХСЦ и прогениторских ћелија. С обзиром да је број посвећених прогениторских ћелија у АГМ региону 10-дневног ембриона 2-3 реда величине мањи него у јетри, може се тврдити да 10. дана ембриогенезе хематопоеза у АГМ региону тек почиње, док су се у главном хематопоетском органу фетуса током овог периода хематопоетске линије већ развиле.

Заиста, за разлику од ранијих (9-11 дана) хематопоетских матичних ћелија жуманчане кесе и АГМ региона, које репопулирају хематопоетско микроокружење новорођенчета, али не и одраслог организма, хематопоетским прогениторским ћелијама ембрионалне јетре старости 12-17 дана више није потребно рано постнатално микроокружење и насељавају хематопоетске органе одрасле животиње ништа горе од новорођенчета. Након трансплантације ембрионалних ХСК јетре, хематопоеза код озрачених одраслих мишева реципијената имала је поликлонални карактер. Поред тога, коришћењем обележених колонија, показано је да је функционисање калемљених клонова потпуно подложно клоналној сукцесији откривеној у коштаној сржи одраслих. Сходно томе, ембрионалне ХСК јетре, обележене под најнежнијим условима, без претходне стимулације егзогеним цитокинима, већ поседују главне атрибуте одраслих ХСК: не захтевају рано постембрионално микроокружење, улазе у стање дубоког мировања након трансплантације и мобилишу се у клонално формирање секвенцијално у складу са моделом клоналне сукцесије.

Очигледно је да је потребно детаљније се задржати на феномену клоналне сукцесије. Еритропоезу спроводе хематопоетске матичне ћелије које имају висок пролиферативни потенцијал и способност диференцијације у све линије посвећених прекурсорских ћелија крвних ћелија. При нормалном интензитету хематопоезе, већина хематопоетских матичних ћелија је у стању мировања и мобилисане су за пролиферацију и диференцијацију, секвенцијално формирајући клонове који се међусобно замењују. Овај процес се назива клонална сукцесија. Експериментални докази о клоналној сукцесији у хематопоетском систему добијени су у студијама са ХСК обележеним ретровирусним трансфером гена. Код одраслих животиња, хематопоезу одржавају многи истовремено функционишући хематопоетски клонови, деривати ХСК. На основу феномена клоналне сукцесије, развијен је репопулациони приступ идентификацији ХСК. Према овом принципу, прави се разлика између дугорочних хематопоетских матичних ћелија (LT-HSC), које су способне да обнављају хематопоетски систем током целог живота, и краткорочних HSC, које ову функцију обављају ограничен временски период.

Ако хематопоетске матичне ћелије посматрамо са становишта приступа репопулације, онда је посебност хематопоетских ћелија ембрионалне јетре њихова способност да стварају колоније које су знатно веће величине од оних у расту ХСК из пупчане врпце или коштане сржи, и то се односи на све врсте колонија. Само ова чињеница указује на већи пролиферативни потенцијал хематопоетских ћелија ембрионалне јетре. Јединствено својство хематопоетских ћелија прогенитора ембрионалне јетре је краћи ћелијски циклус у поређењу са другим изворима, што је од великог значаја са становишта ефикасности репопулације хематопоетских органа током трансплантације. Анализа ћелијског састава хематопоетске суспензије добијене из извора зрелог организма указује да су у свим фазама онтогенезе нуклеарне ћелије претежно представљене коначно диференцираним ћелијама, чији број и фенотип зависе од онтогенетске старости донора хематопоетског ткива. Конкретно, суспензије мононуклеарних ћелија коштане сржи и крви из пупчане врпце састоје се од више од 50% зрелих ћелија лимфоидне серије, док хематопоетско ткиво ембрионалне јетре садржи мање од 10% лимфоцита. Поред тога, ћелије мијелоидне лозе у ембрионалној и феталној јетри су представљене углавном еритроидном серијом, док у крви из пупчане врпце и коштаној сржи преовлађују гранулоцитно-макрофагни елементи.

Такође је важно да ембрионална јетра садржи комплетан сет најранијих хематопоетских прекурсора. Међу њима треба истаћи еритроидне, гранулопоетске, мегакариопоетске и мултилинијске ћелије које формирају колоније. Њихови примитивнији прекурсори - LTC-IC - способни су за пролиферацију и диференцијацију in vitro током 5 недеља или дуже, а такође задржавају функционалну активност након уживљавања у тело примаоца током алогене, па чак и ксеногене трансплантације имунодефицијентним животињама.

Биолошка сврсисходност превласти еритроидних ћелија у ембрионалној јетри (до 90% укупног броја хематопоетских елемената) последица је потребе да се брзо растући волумен крви фетуса у развоју обезбеди еритроцитном масом. У ембрионалној јетри, еритропоезу представљају нуклеарни еритроидни прекурсори различитог степена зрелости који садрже фетални хемоглобин (a2u7), који, због свог већег афинитета за кисеоник, обезбеђује ефикасну апсорпцију потоњег из мајчине крви. Интензивирање еритропоезе у ембрионалној јетри повезано је са локалним повећањем синтезе еритропоетина (EPO). Важно је напоменути да је само присуство еритропоетина довољно за реализацију хематопоетског потенцијала хематопоетских ћелија у ембрионалној јетри, док је за посвећеност HSC коштане сржи и крви из пупчане врпце еритропоези потребна комбинација цитокина и фактора раста који се састоје од EPO, SCF, GM-CSF и IL-3. Истовремено, ране хематопоетске прогениторске ћелије изоловане из ембрионалне јетре, које немају рецепторе за ЕПО, не реагују на егзогени еритропоетин. За индукцију еритропоезе у суспензији мононуклеарних ћелија ембрионалне јетре, неопходно је присуство напреднијих ћелија осетљивих на еритропоетин са фенотипом CD34+CD38+, које експресују ЕПО рецептор.

У литератури још увек не постоји консензус о развоју хематопоезе у ембрионалном периоду. Функционални значај постојања екстра- и интраембрионалних извора хематопоетских ћелија прогенитора није утврђен. Међутим, нема сумње да је у људској ембриогенези јетра централни орган хематопоезе и да у 6. до 12. недељи гестације служи као главни извор хематопоетских матичних ћелија које насељавају слезину, тимус и коштану срж. ГДР обезбеђују обављање одговарајућих функција у пре- и постнаталном периоду развоја.

Треба још једном напоменути да ембрионална јетра, у поређењу са другим изворима, карактерише највећи садржај ХСК. Приближно 30% CD344 ћелија ембрионалне јетре има фенотип CD38. Истовремено, број лимфоидних ћелија прогенитора (CD45+) у раним фазама хематопоезе у јетри није већи од 4%. Утврђено је да, како се фетус развија, од 7. до 17. недеље гестације, број Б-лимфоцита прогресивно расте са месечним „кораком“ од 1,1%, док ниво ХСК трајно опада.

Функционална активност хематопоетских матичних ћелија такође зависи од периода ембрионалног развоја њиховог извора. Проучавање активности формирања колонија ћелија јетре људских ембриона у 6-8 и 9-12 недеља гестације током култивације у полутечној подлози у присуству SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 и EPO показало је да је укупан број колонија 1,5 пута већи када се сеју HSC ембрионалне јетре у раним фазама развоја. Истовремено, број мијелопоезних прогениторских ћелија као што је CFU-GEMM у јетри у 6-8 недеља ембриогенезе је више од три пута већи од њиховог броја у 9-12 недеља гестације. Генерално, активност формирања колонија хематопоетских ћелија јетре ембриона у првом тромесечју гестације била је значајно већа него код ћелија јетре фетуса у другом тромесечју трудноће.

Горе наведени подаци указују на то да се ембрионална јетра на почетку ембриогенезе одликује не само повећаним садржајем раних хематопоетских ћелија прогенитора, већ се њене хематопоетске ћелије карактеришу ширим спектром диференцијације у различите ћелијске линије. Ове карактеристике функционалне активности хематопоетских матичних ћелија ембрионалне јетре могу имати одређени клинички значај, јер њихове квалитативне карактеристике нам омогућавају да очекујемо изражен терапеутски ефекат приликом трансплантације чак и малог броја ћелија добијених у раним фазама гестације.

Ипак, проблем количине хематопоетских матичних ћелија потребних за ефикасну трансплантацију остаје отворен и релевантан. Чине се покушаји да се он реши коришћењем високог потенцијала саморепродукције хематопоетских ћелија ембрионалне јетре in vitro када се стимулишу цитокинима и факторима раста. Константном перфузијом раних ембрионалних ХСК јетре у биореактору, након 2-3 дана, могуће је добити количину хематопоетских матичних ћелија на излазу која је 15 пута већа од њиховог почетног нивоа. Поређења ради, треба напоменути да су потребне најмање две недеље да би се постигло 20-струко повећање излаза ХСК људске крви из пупчане врпце под истим условима.

Дакле, ембрионална јетра се разликује од других извора хематопоетских матичних ћелија по већем садржају и посвећених и раних хематопоетских прогениторских ћелија. У култури са факторима раста, ембрионалне ћелије јетре са фенотипом CD34+CD45Ra1 CD71l0W формирају 30 пута више колонија од сличних ћелија из пупчане врпце и 90 пута више од HSC коштане сржи. Најизраженије разлике у наведеним изворима су у садржају раних хематопоетских прогениторских ћелија које формирају мешовите колоније - количина CFU-GEMM у ембрионалној јетри премашује ону у крви из пупчане врпце и коштаној сржи за 60 и 250 пута, респективно.

Такође је важно да је до 18. недеље ембрионалног развоја (период почетка хематопоезе у коштаној сржи) више од 60% ћелија јетре укључено у спровођење хематопоетске функције. Пошто људски фетус нема тимус и, сходно томе, тимоците до 13. недеље развоја, трансплантација хематопоетских ћелија из ембрионалне јетре од 6-12 недеља гестације значајно смањује ризик од развоја реакције „калемљење против домаћина“ и не захтева избор хистокомпатибилног донора, јер омогућава релативно лако постизање хематопоетског химеризма.