Примена ћелијских технологија за побољшање изгледа ожиљака

Савремену науку карактерише брзи развој низа сродних дисциплина, уједињених под општим називом „биотехнологија“. Овај део науке, заснован на најновијим достигнућима у области биологије, цитологије, молекуларне генетике, генетског инжењеринга, трансплантологије, има за циљ да искористи огроман потенцијал својствен биљним и животињским ћелијама – основним структурним јединицама свих живих бића. „Жива ћелија је готов биотехнолошки реактор у коме се не реализују само процеси који доводе до формирања финалног производа, већ и низ других који помажу у одржавању каталитичке активности система на високом нивоу“, – Џон Вудворд, 1992. Почетак ћелијске науке положен је 1665. године, када је енглески физичар Р. Хук створио први микроскоп и открио ћелије – ћелије („ћелије“) у плути. Године 1829, М. Шлајден и Т. Шван су поткрепили „ћелијску теорију“, којом су доказали да се сва жива бића састоје од ћелија. Године 1858, Р. Вирхов је доказао да су све болести засноване на кршењу структурне организације и метаболизма ћелија. Постао је оснивач „ћелијске патологије“. Фундаментални допринос науци о ћелији дали су 1907-1911. године Р. Харисон и А.А. Максимов, који су доказали могућност култивације ћелија ван тела. Њихов рад је показао да се за култивацију ћелија животињска ткива и делови биљака морају механички раздвојити на мале комаде. Да би се изоловале ћелије, ткива се секу оштрим ножем или микротомом на танке пресеке, приближно 0,5-1,0 мм. Физичко раздвајање ћелија назива се имобилизација. Изоловане ћелије се добијају ензимском дисперзијом комада биљака или ткива. Након млевења оштрим маказама, комадићи се третирају трипсином или колагеназом да би се добила суспензија - суспензија појединачних ћелија или њихових микроагрегата у посебном медијуму. Алгинатни гелови (калцијум алгинат) се широко користе за имобилизацију биљних ћелија. Доказано је да имобилизоване биљне и животињске ћелије задржавају способност биосинтезе. Продукти ћелијске биосинтезе се акумулирају у ћелијама, њихова експресија се одвија или спонтано или уз помоћ посебних супстанци које подстичу повећану пропустљивост ћелијских мембрана.

Гајење животињских ћелија је много сложенији процес од гајења биљних ћелија, који захтева посебну модерну опрему, високу технологију, присуство различитих медија, фактора раста дизајнираних да очувају виталност ћелија и одрже их у стању високе функционалне активности. Утврђено је да је већина ћелија чврстих ткива, као што су ткива бубрега, јетре и коже, површински зависна, тако да се могу гајити in vitro само у облику танких листова или монослојева директно повезаних са површином супстрата. Животни век, пролиферација и функционална стабилност ћелија добијених ензимском дисперзијом ткива у великој мери зависе од супстрата на којем се гаје. Познато је да све ћелије добијене из ткива кичмењака имају негативно површинско наелектрисање, тако да су позитивно наелектрисани супстрати погодни за њихову имобилизацију. Изоловане ћелије добијене директно из целих ткива могу се одржавати у примарној култури у имобилизованом стању уз одржавање високе специфичности и осетљивости током 10-14 дана. Имобилисане, површински зависне ћелије данас играју главну улогу у биологији, посебно у клиничким истраживањима. Користе се за проучавање циклуса развоја ћелија, регулације њиховог раста и диференцијације, функционалних и морфолошких разлика између нормалних и туморских ћелија. Имобилисани ћелијски монослојеви се користе у биотестовима, за квантитативно одређивање биолошки активних супстанци, као и за проучавање дејства различитих лекова и токсина на њих. Лекари свих специјалности већ деценијама показују велико интересовање за ћелију као терапеутско средство. Ћелијске технологије се тренутно брзо развијају у овом правцу.

Почетак ткивне и ћелијске терапије повезан је са именом познатог руског научника В. П. Филатова, који је 1913. године поставио темеље доктрине ткивне терапије, проучавајући резултате трансплантација рожњаче од здравих донора пацијентима са катарактом. У процесу рада са трансплантацијама рожњаче, открио је да се рожњача конзервисана на хладноћи 1-3 дана на температури од -2-4 степена Ц боље прихвата него свежа. Тако је откривено својство ћелија да у неповољним условима луче неке супстанце које побуђују виталне процесе у трансплантираним ткивима и регенеративне у ткивима примаоца. Ткиво и ћелије одвојене од тела налазе се у стању стреса, односно успорене виталне активности. Циркулација крви у њима се зауставља, а самим тим и исхрана. Дисање ткива је изузетно отежано, инервација и трофика су поремећени. Налазећи се у новом квалитативном стању, прилагођавајући се новим условима постојања, ћелије производе посебне супстанце са лековитим својствима. Ове супстанце непротеинске природе В. П. Филатов је назвао биогеним стимулансима. Заједно са В. В. Скородинском је утврдио да се материјал из животиња и биљака може слободно аутоклавирати на температури од 120 степени Целзијуса током сат времена након чувања у неповољним условима, и да не само да није изгубио активност, већ је напротив, повећао, што је објашњено ослобађањем биолошких стимуланса из конзервисаних ткива. Поред тога, изгубио је антигена својства, што је значајно смањило могућност одбацивања. Конзервисани стерилни материјал је уношен у организам имплантацијом (плантацијом) под кожу или у облику ињекција екстраката, са адекватним резултатима. Такође је откривено да фетална ткива садрже знатно већи број биолошки активних супстанци него ткива одраслих јединки, а неки фактори се налазе само у ембрионима. Инокулирана фетална ткива организам примаоца не перципира као страна због одсуства протеина одговорних за специфичност врсте, ткива и индивидуале (протеини главног комплекса хистокомпатибилности) у цитоплазматским мембранама. Као резултат тога, инокулација ткива животињских фетуса у људски организам не покреће механизме имунолошке заштите и реакције некомпатибилности и одбацивања. В. П. Филатов је широко користио људску плаценту и кожу у својој медицинској пракси. Курсеви лечења састојали су се од 30-45 ињекција екстраката ткива и 1-2 имплантације аутоклавираног ткива.

Започевши своја истраживања са људским и животињским ткивима и ћелијама, своја уопштавања је пренео на биљни свет. Спроводећи експерименте са живим деловима биљака (алоја, боквица, агава, врхови цвекле, кантарион итд.), створио је неповољне услове за њих, стављајући исечене листове на тамно место, пошто је биљци потребна светлост за њене виталне функције. Такође је изоловао биогене стимулансе из естуарског блата и тресета, због чињенице да се блато и тресет формирају уз учешће микрофлоре и микрофауне.

Терапија ткивима је добила нови круг свог развоја крајем 70-их, када су знање и искуство акумулирано деценијама омогућили коришћење животињских и биљних ткива и ћелија на квалитативно новом нивоу за лечење људи и продужење њиховог активног животног века. Тако су у неким домаћим клиникама и бројним страним, жене у физиолошкој менопаузи са климактеријским синдромом или на позадини оваријектомије почеле да се подвргавају ткивној терапији феталним ткивима плаценте, хипоталамуса, јетре, јајника, тимуса и штитне жлезде како би се успорио процес старења, развој атеросклерозе, остеопорозе, дисфункције имуног, ендокриног и нервног система. У једној од најпрестижнијих геронтокозметолошких клиника у Западној Европи, ињекције екстраката добијених из феталних ткива гонада овнова користе се у исте сврхе већ неколико деценија.

У нашој земљи, биостимулишући третман је такође нашао широку примену. До недавно су пацијентима са разним болестима активно преписиване инјекције екстраката плаценте, алое, каланхое, седума мајор (биосед), ФиБС-а, пелоидног дестилата, пелоида, тресета, хумисола припремљеног по методи В. П. Филатова. Тренутно је готово немогуће купити ове високо ефикасне и јефтине домаће препарате ткива животињског, биљног и минералног порекла у апотекама.

Основа за добијање различитих биогених препарата из људских ткива и органа увозне производње, као што су румалон (из хрскавичног ткива и коштане сржи), актовегин (из телеће крви), солкосерил (екстракт говеђе крви), као и домаћи препарати - стакласто тело (из стакластог тела ока говеда), керакол (из рожњаче говеда), спленин (из слезине говеда), епиталамин (из епиталамо-епифизне регије) су такође истраживања В. П. Филатова. Уједињујуће својство за све препарате ткива је општи ефекат на цело тело. Тако је „Ткивна терапија“ академика В. П. Филатова формирала основу за већину савремених достигнућа и праваца у хирургији, имунологији, акушерству и гинекологији, геронтологији, комбустиологији, дерматологији и козметологији везаних за ћелију и производе њене биосинтезе.

Проблем трансплантације ткива забрињава човечанство од давнина. Тако се у Еберсовом папирусу, датираном 8.000 година пре нове ере, већ помиње употреба трансплантације ткива за надокнађивање дефеката у појединим деловима тела. У „Књизи живота“ индијског научника Сушруте, који је живео 1.000 година пре нове ере, налази се детаљан опис рестаурације носа са коже образа и чела.

Потреба за донорском кожом расла је пропорционално повећању броја пластичних и реконструктивних операција. У том смислу, почела је да се користи кожа кадавера и фетуса. Постојала је потреба за очувањем донорских ресурса и проналажењем начина замене људске коже животињским ткивима, и разним опцијама моделирања коже. И управо у том правцу су научници радили када је 1941. године П. Медовар први демонстрирао фундаменталну могућност раста кератиноцита in vitro. Следећа важна фаза у развоју ћелијских технологија био је рад Карасека М. и Чарлтона М., који су 1971. године извршили прву успешну трансплантацију аутологних кератиноцита из примарне културе на ране зечева, користећи колагенски гел као супстрат за култивацију CC, што је побољшало пролиферацију ћелија у култури. J. Rheinvvald. H Green. развио је технологију за серијско култивисање великих количина људских кератиноцита. Године 1979, Грин и његови коаутори открили су перспективе за терапеутску употребу ћелијске културе кератиноцита у рестаурацији коже код опсежних опекотина, након чега је ова техника, стално усавршавана, почела да се користи од стране хирурза у центрима за опекотине у иностранству и нашој земљи.

У процесу проучавања живих ћелија, утврђено је да ћелије производе не само биогене стимулаторе непротеинског порекла, већ и бројне цитокине, медијаторе, факторе раста, полипептиде, који играју важну улогу у регулисању хомеостазе целог организма. Утврђено је да различите ћелије и ткива садрже пептидне биорегулаторе, који имају широк спектар биолошког дејства и координирају процесе развоја и функционисања вишећелијских система. Почела је ера коришћења ћелијске културе као терапијског средства. У нашој земљи, трансплантација суспензије фибробласта и вишеслојних слојева ћелија кератиноцита усвојена је у комбустиологији последњих деценија. Овако активно интересовање за трансплантацију ћелија коже код опечених пацијената објашњава се потребом за брзим затварањем великих површина опекотина и недостатком донорске коже. Могућност изоловања ћелија из малог комада коже способног да покрије површину ране 1000 или чак 10.000 пута већу од површине донорске коже показала се веома атрактивном и важном за комбустиологију и пацијенте са опекотинама. Проценат прихватања слоја кератиноцита варира у зависности од површине опекотине, старости и здравственог стања пацијента од 71,5 до 93,6%. Интересовање за трансплантацију кератиноцита и фибробласта повезано је не само са могућношћу брзог затварања дефекта коже, већ и са чињеницом да ови трансплантати имају снажан биолошки активан потенцијал за побољшање изгледа ткива добијених као резултат трансплантације. Формирање нових крвних судова, ублажавање хипоксије, побољшана трофика, убрзано сазревање незрелог ткива - то је морфофункционална основа за ове позитивне промене које настају услед ослобађања фактора раста и цитокина од стране трансплантираних ћелија. Дакле, захваљујући увођењу прогресивних ћелијских технологија за трансплантацију вишећелијских слојева аутологних и алогених кератиноцита и фибробласта на велике површине рана у медицинску праксу, комбустиолози су успели не само да смање стопу смртности жртава опекотина са високим процентом кожних лезија, већ и да квалитативно побољшају ожиљно ткиво које неизбежно настаје на месту опекотина IIb и IIIa и b степена. Искуство комбустиолога стечено у лечењу површина рана код пацијената са опекотинама навело је на идеју коришћења већ модификоване Гринове методе у дерматохируршкој пракси за различите кожне и козметичке патологије (трофични чиреви, витилиго, невуси, булозна епидермолиза, уклањање тетоважа, промене на кожи повезане са старењем и за побољшање изгледа ожиљака).

Употреба алогених кератиноцита у хирургији, комбустиологији и дерматокозметологији има низ предности у односу на употребу аутологних кератиноцита, будући да се ћелијски материјал може унапред припремити у неограниченим количинама, конзервирати и користити по потреби. Такође је познато да алогени КК имају смањену антигенску активност, јер када се гаје in vitro, губе Лангерхансове ћелије, које су носиоци антигена HLA комплекса. Употребу алогених КК поткрепљује и чињеница да се оне након трансплантације, према различитим ауторима, замењују аутологним у року од 10 дана до 3 месеца. У том смислу, данас су у многим земљама створене ћелијске банке, захваљујући којима је могуће добити ћелијске трансплантате у потребној количини и у право време. Такве банке постоје у Немачкој, САД и Јапану.

Интересовање за употребу ћелијских технологија у дерматокозметологији је због чињенице да „ћелијске композиције“ носе снажан биоенергетски и информациони потенцијал, захваљујући коме је могуће добити квалитативно нове резултате лечења. Аутокини које луче трансплантиране ћелије (фактори раста, цитокини, азот-оксид, итд.) првенствено делују на сопствене фибробласте тела, повећавајући њихову синтетичку и пролиферативну активност. Ова чињеница је посебно привлачна истраживачима, јер је фибробласт кључна ћелија дермиса, чија функционална активност одређује стање свих слојева коже. Такође је познато да се након повреде коже каутером, ласером, иглом и другим инструментима, кожа обнавља свежим матичним прекурсорима фибробласта из коштане сржи, масног ткива и капиларних перицита, што доприноси „подмлађивању“ фонда телесних ћелија. Оне активно почињу да синтетишу колаген, еластин, ензиме, гликозаминогликане, факторе раста и друге биолошки активне молекуле, што доводи до повећане хидратације и васкуларизације дермиса, побољшавајући његову чврстоћу,