Експериментални рад на трансплантацији алогених кератиноцита на вештачки створене ожиљке белих пацова

Жеља за коришћењем ћелијског потенцијала и потреба за проналажењем нових ефикасних метода за побољшање естетског изгледа ожиљака довела је до идеје да се покуша проучити могућност трансплантације кератиноцита на површине ожиљака.

Да би се доказала вероватноћа коришћења културе кератиноцита за побољшање изгледа ожиљака, спроведена је експериментална студија на белим лабораторијским пацовима, којима су креиране ожиљне површине. Модел ожиљка пацова добијен је као резултат зарастања вештачки нанетих рана на леђима, дуж кичме. Пацовима су исечени идентични комади коже, величине 2x3 цм. 2,5 месеца након операције „моделирања ожиљка“, пацовима је урађена дермабразија (уклањање горњих слојева ожиљка помоћу термокаустика) и трансплантирани су алогени кератиноцити, изоловани из коже младунаца пацова 2-4 дана након рођења.

Изолација и култивација ћелија епидермиса пацова спроведена је у лабораторији за ћелијске технологије Института за цитологију Руске академије наука коришћењем следеће технологије.

Кожа је испрана у Ханковом физиолошком раствору који садржи 200 U/ml гентамицина и исечена на мале комаде, површине 0,2-0,5 cm2 ^. Комадићи коже су инкубирани у 0,5% раствору диспазе у уравнотеженом фосфатно пуферованом раствору соли на 37°C током 1 сата. Комадићи су затим пребачени у Дулбеков фосфатно пуферовани физиолошки раствор и епидермис је одвојен од дермиса. Епидермис је инкубиран у 0,125% раствору трипсина током 10-15 минута уз мешање на 50 о/мин, након чега је дејство ензима заустављено додавањем 5% феталног говеђег серума. Једна трећина добијене ћелијске суспензије је коришћена у чистом облику за једну од опција за трансплантацију на ожиљке, друга трећина је гајена на биокомпатибилним домаћим филмским премазима „Polypor“, а трећа - на Петријевим шољама без подлоге. Операција дермабразије насталих ожиљака код пацова са накнадном трансплантацијом ћелија епидермиса пацова на њих изведена је под етарском анестезијом коришћењем термичког каутеризатора.

У првој групи пацова, након дермабразије, стерилни комадићи камбрика су постављени на полирану, испрану физиолошким раствором и осушену површину ожиљка, на које је нанета промућкана суспензија алогених епидермоцита пацова у концентрацији од 1,5 милиона ћелија на 1 мл (према Институту за цитологију). Комадићи камбрика су постављени на полирани ожиљак тако да су ћелије лежале на површини ожиљка. Преко је постављен завој од неколико слојева газе, који је пришивен за ивице ожиљка.

Део добијене ћелијске суспензије посејан је у Петријеве шоље на стерилне Polypore филмове исечене у облику шоља, други део - на Петријеве шоље без филма. Култивација је спроведена у FAD медијуму, који се састоји од смеше DMEM и F12 медијума у односу 3:1, уз додатак 10% феталног говеђег серума, 5 μг/мл инсулина (Sigma), 0,5 μг/мл хидрокортизон хемисукцината (Sigma), 10 μг/мл епидермалног фактора раста EGF (Институт за цитологију РАС, Санкт Петербург). Друга и трећа група пацова, по 7 јединки, оперисане су 6 дана након прве. До овог времена, од суспензије посејаних кератиноцита у Петријевим шољама формирани су вишеслојни слојеви, који су трансплантирани у пацове. Другој групи су трансплантирани епидермоцити на филму, трећој - вишеслојни слој без подлоге. Након 7 дана, добијени вишеслојни слојеви алогених кератиноцита (MPALK), посејани на „Polypore“ филмовима, трансплантирани су као култура директно на површину ране. Преко тога, филм је, како би се избегло његово кидање, фиксиран вишеслојним газним завојем и пришивен за кожу пацова.

Пре трансплантације кератиноцита трећој групи пацова узгајаних без супстрата, ПАЦ је одвојен од дна Петријеве шоље третирањем диспазом, која има способност селективног нарушавања дермално-епидермалних веза. Када делује на вишеслојни слој, диспаза нарушава везу ћелија базалног слоја са дном Петријеве шоље и има знатно мањи утицај на међућелијске везе, што омогућава потпуно „уклањање“ слоја. Одвајање вишеслојног ћелијског слоја диспазом је спроведено на следећи начин. Транспортни медијум је исцеђен из Петријевих шоља, ћелијски слојеви су три пута испрани хранљивом подлогом која садржи антибиотике, посебно гентамицин (0,2 мг/мл). Вишеслојни слојеви су напуњени 0,125% раствором диспазе („Сигма“) и стављени у термостат, где су инкубирани на t=37°C током 20-30 минута. Појава белог обода који се љушти дуж периферије слоја је показатељ почетка процеса његовог одвајања од ивица и дна Петријеве шоље. Неколико минута након почетка процеса одвајања, раствор диспазе је оцеђен, епителни слојеви су испрани 2-3 пута медијумом. На површину епидермалног слоја нанесен је комад стерилног завоја за ране „Лита-колор“ исечен на величину шоље, на који је залепљен слој одвојен диспазом, додатно одлепљен са дна шоље шпатулом. Користећи пинцету за очи, слој је заједно са премазом салвете „Лита-колор“ (Русија) откинут са дна Петријеве шоље и пажљиво пренет на припремљену површину ожиљка. Салвете „Лита-колор“ садрже гентамицин и егзолин (екстракт колагена), који су, када се навлаже остацима подлоге за раст, а затим и физиолошким раствором, набубрили и постали савремени завој за ране, пружајући добру заштиту од спољашње инфекције и брзо зарастање захваљујући структури која упија влагу.

Вишеслојни газни завоји су постављени на Полипор фолије и Лита-бојне салвете и пришивени на кожу пацова ради јаче фиксације. Сваки пацов је смештен у посебан кавез како би се створили оптимални услови за његово одржавање и прихватање трансплантираних кератиноцита. Завоји пацова којима је трансплантирана суспензија и вишеслојни слој епидермоцита уклоњених диспазом, влажени су стерилним физиолошким раствором неколико пута дневно како би се створили најповољнији услови за прихватање ћелија. С обзиром на то да је Полипор фолија била непропусна за воду, завоји пацова у другој групи нису влажени, што је била једна од предности у односу на трансплантације без фолија. Завоји су уклоњени након 10 дана. Клиничка слика ожиљака након трансплантације ћелија мало се разликовала од ожиљака без трансплантације, осим по њиховој ружичастој боји (због дермабразије) и већем љуштењу. Ова чињеница сугерише да одмах након што су завоји са ране отпали са МПЦ-ом, није дошло до промена у ожиљку.

Узимање материјала за биопсију од пацова.

Након 1, 2, 5 и 9 месеци након трансплантације алогених кератиноцита пацова на полиране ожиљке белих пацова, узет је материјал за хистолошки, цитоморфолошки и електронско-микроскопски преглед. Узорци нормалне коже пацова и ожиљка без ћелијске трансплантације узети су као контрола. Анестезија пацова је извршена етарском анестезијом.

Након анестезије, из обележених подручја су узети комадићи ожиљног ткива на које су трансплантирани кератиноцити помоћу биопсијског бушотина пречника 2 mm и стављени у 2,5% раствор глутаралдехида ради припреме материјала за електронско-микроскопски преглед. Комадићи ткива узети за хистолошки преглед стављени су у 10% неутрални раствор формалина, након чега је следило пропуштање кроз алкохоле и утапање у парафин, након чега је следило сечење ултратанких пресека и њихово посматрање у светлосно-оптичком микроскопу.

Контрола I. Нормална кожа пацова.

Да би се видела разлика између микроскопске слике нормалне коже пацова измењене ожиљцима и ожиљака у одређеним временима након трансплантације МПЦ-а, фотографије и описи истих су приказани у свим фазама ове студије.

Епидермис нормалне коже састоји се од 7-9 слојева ћелија. Стратум корнеум је умерене дебљине. На неким местима се састоји од 6-8 слојева рожнатих љуски. Базални слој је представљен цилиндричним ћелијама са великим, светлим, правилно обликованим једрима и неколико нуклеола. Дезмозомске везе између ћелија и са базалном мембраном су јасно изражене. Испод добро дефинисане базалне мембране, која има мале израслине у субепидермалном слоју, паралелно са њом леже нежни снопови колагенских и еластинских влакана, међу којима су издужени фибробласти, мали судови. У дубљим слојевима, снопови колагенских и еластинских влакана леже у различитим правцима. Међу њима су многи судови са танким зидовима истог калибра, ћелијски елементи (фибробласти, мастоцити, леукоцити). Велики број фоликула длаке, лојних жлезда.

Контрола 2. Ожиљак од пацова, стар 2 месеца.

Клиничка слика. Ожиљци су бледо ружичасти, љуште се, местимично остају красте. Њихова површина се смањила због контракције колагенских влакана и постала је приближно 3,0-3,5 цм ^:. Кожни додаци су одсутни.

Микроскопска слика. Епидермис се састоји од 3-5 слојева ћелија, набораних, представљених заобљеним базалним ћелијама, једним редом шиљастих, 1-2 реда грануларних са кератохијалинским зрнцима у горњем слоју, постоје подручја интрацелуларног едема. Стратум корнеум је неравномерно измењен од веома танког до задебљаног. Примећује се ожиљно наборање услед (контракције) ожиљног ткива. Набори продиру до папиларног слоја и стварају утисак папила. Граница између епидермиса и дермиса је права линија. Базална мембрана се не прати свуда. У доњем делу субепидермалног и дубљим слојевима налазе се судови са дебелим, растреситим зидом, многи су пусти, са стазом. Око судова долази до накупљања макрофага, фибробласта. Макрофаги окружују еритроците ослобођене из капилара и фагоцитују их. У површинскијим слојевима налазе се мали капилари. Испод епидермиса су лабаво смештена колагена влакна. У дубљем слоју ожиљка налазе се груби снопови колагених влакана, међу којима има много фибробласта.

Ожиљак пацова месец дана након трансплантације кератиноцита пацова.

Клиничка слика. Ожиљци су ружичасти, њихова површина је смањена, посебно у пречнику, и у просеку је 2,5-3 цм ^2. Длаке и лојне жлезде су одсутне.

Подаци микроскопског испитивања материјала добијеног од пацова са трансплантацијом МПаЛК на филму и МПаЛК без подлоге су практично идентични. Међутим, чисто технички, рад са МПаЛК без подлоге је много компликованији и мукотрпнији него при узгоју МПаЛК на подлози, стога смо у даљем проучавању питања трансплантације кератиноцита у ожиљке користили вишеслојни камбрик као основу за узгој („подлоге“).

Микроскопска слика. Примећује се задебљање епидермиса на 15-20 слојева, скоро до средине којих кератиноцити имају узак, издужен, вертикалан облик и компактан распоред. Базалне ћелије су распоређене у неравној линији. Њихова језгра су светла, велика, заобљена са једним или два нуклеола, што указује на њихову високу синтетичку и пролиферативну активност. Граница између епидермиса и дермиса је права линија. Спинозни слој је добро развијен, састоји се од 3-5 слојева заобљених ћелија, постоје 2-нуклеоларне ћелије.

Непосредно испод базалне мембране налазе се густо распоређени танки снопови колагенских влакана, паралелно са њима налази се велики број напуштених крвних судова, дубља колагенска влакна су грубља, сакупљена у густе снопове. Много великих фибробласта, мастоцита (2-3 у видном пољу), макрофага, леукоцита и напуштених крвних судова, чији су зидови опуштени, око њих су лабаво распоређена колагенска влакна. У неким крвним судовима постоји стаза, дијапедеза формираних елемената. Око крвних судова налазе се фибробласти, појединачни лимфоцити. Кожни апендици су одсутни.

Приликом трансплантације суспензије кератиноцита на полирани ожиљак, микроскопска слика се разликује од претходне. Код већине животиња, епидермис је танак и састоји се од 5-6 слојева ћелија. Доњи слој се састоји од ћелија неправилног, полигоналног облика са језгрима округло-неправилног облика. Стање субепидермалног слоја је слично његовом стању у групи животиња без трансплантације MPALK.

У овом случају, можемо говорити или о кашњењу у процесима који прате трансплантацију ћелија, или о великом губитку ћелија трансплантираних у облику суспензије. Стога је изведен закључак о нецелесношћу корекције ожиљака трансплантацијом кератиноцита у облику суспензије.

Ожиљак пацова 2 месеца након трансплантације кератиноцита пацова.

Клиничка слика. Ожиљак изгледа танак и нежан. На местима се примећује љуштење и љускаве мрље.

Микроскопска слика. Стратум корнеум је задебљан, местимично - хиперкератоза. Епидермис је задебљан, састоји се од 12-20 редова ћелија. Граница између епидермиса и дермиса је права линија. Нежна колагенска влакна испод епидермиса леже прилично густо. У дубљим слојевима ожиљка, сакупљена су у велике грубе снопове. У субепидермалном слоју појављују се нове васкуларне формације. У доњим слојевима ожиљног ткива налази се много напуштених крвних судова који се налазе паралелно са површином епидермиса. Велики фибробласти су равномерно распоређени у дебљини ожиљка, постоје џиновски, вишегранати, много макрофага.

Ожиљак пацова 5 месеци након трансплантације ћелија епидермиса пацова.

Клиничка слика. Ожиљак изгледа равномерно, глатко без љуштења, постоје појединачне длачице, њихова густина је већа на периферији ожиљака, што указује на маргинално урастање фоликула длаке у ожиљак и ново формирање фоликула длаке. Површина ожиљака се наставља смањивати.

Микроскопска слика. Епидермис је још увек дебео (15-20 слојева, на неким местима и до 30), у горњим слојевима је испуњен зрнцима кератохијалина. Базална мембрана је јасно видљива. Испод ње, колагенска влакна леже лабаво. У доњим слојевима, колаген је снажнији и гушће збијен. Међу колагенским сноповима има много капилара. У горњим слојевима, број напуштених крвних судова је смањен. Спој епидермиса и дермиса је благо таласаст. На неким местима постоје дубоки епидермални израсли у ожиљном ткиву. Новоформирани крвни судови су видљиви међу колагенским влакнима. Појављују се појединачни фоликули длаке и лојне жлезде.

Ожиљак пацова 9 месеци након трансплантације МПА ћелија епидермиса пацова.

Клиничка слика. Ожиљци су постали знатно мањи у поређењу са ранијим периодима, њихова површина је у просеку око 1,5-2,0 цм ^2. Ожиљци су неравномерно прекривени финим длачицама, посебно на периферији. Остаје мање фино-плочасто љуштење.

Микроскопска слика.

Епидермис је постао тањи, представљен је са 6-8 редова ћелија, по структури подсећа на епидермис нормалне коже пацова, само што је густина ћелија 1 мм већа и оне су мање. Базални слој се састоји од малих округло-цилиндричних ћелија. Базална мембрана је добро изражена, хемидесмозоми су јасно видљиви. Примећује се присуство епидермалних израслина у субепидермалном слоју. Папиларни слој је изражен дуж целе дужине ожиљка. Ове чињенице указују на то да је до овог тренутка адхезија трансплантираних кератиноцита постала много јача са основним ожиљним ткивима. Стога, нега ожиљака код људи са МПАЛК трансплантацијом 9 месеци након МПЦ трансплантације може бити традиционална. Испод епидермиса, колагенска влакна су нежнија него у дубоким слојевима. Појавили су се многи крвни судови, посебно површински. Зидови већих крвних судова су задебљани. Фоликули длаке и лојне жлезде су у великим количинама. Микроскопска слика подсећа на ткиво слично дермису.

Резултати експерименталног рада и њихова дискусија.

У току овог рада, кератиноцити у различитим облицима су трансплантирани на вештачки створене ожиљке коже пацова након операције дермабразије - на покривачима за ране, као суспензија на камбрику и као вишеслојни слој без подлоге. Рад је спроведен са циљем добијања морфолошких података о ефекту трансплантираних алогених кератиноцита на ожиљке, као и одређивања оптималних опција трансплантације.

Утврђено је да су све три методе трансплантације изводљиве, али трансплантација МПАЦ-а без подлоге је веома радно интензиван поступак, током којег МПАЦ може бити повређен, што утиче на резултате трансплантације. Штавише, овај метод трансплантације искључује рад на великим површинама.

Трансплантација суспензије кератиноцита је много исплативија метода, не захтева дуготрајно узгајање ћелија и једноставна је у верзији коју предлажемо коришћењем стерилних камбричких бланкова, чије величине одговарају величини ожиљака. Кашњење у терапијском ефекту при трансплантацији ћелијске суспензије за око месец дана у поређењу са МПК на премазу за рану није значајна тачка са трајањем лечења од више месеци. Познато је да када се МПК трансплантира пацијентима са опекотинама, трансформација структуре коже се одвија постепено и током неколико година. Трансплантација културе кератиноцита на премазе за ране је најпогоднија и најперспективнија метода, али и знатно скупља. Поред тога, тренутно је потребна потрага за напреднијим опцијама премаза које би требало да буду флексибилне, хигроскопне, да имају бактериостатска или бактерицидна својства и да буду биолошки неутралне за ћелије. Филм „Полипор“ - средња верзија домаћег филмског премаза за ране, упркос неким несавршеностима, омогућио нам је да у експерименту проучимо трансплантацију кератиноцита пацова на ожиљке и извучемо закључке о ефикасности овог правца лечења ожиљака.

Аутори који су трансплантирали МПК на опекотине су приметили да је током прве недеље након трансплантације вишеслојног слоја кератиноцита на саниране ране, епидермис задебљао и стратификационо се наслањао. Сви слојеви епидермиса били су јасно видљиви. Занимљиво је да је број ћелијских слојева у трансплантатима био 10-30% већи него у биопсијама коже. Аутори су приметили појаву кератохијалинских гранула 5. дана након трансплантације МПК, а базалне мембране и хемидесмозома - већ 3. дана.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) су открили да је у раним фазама након трансплантације МПЦ пацијентима са дефектима коже пуне дебљине након опекотина, веза између дермиса и епидермиса веома слаба и праволинијски облик, папиларни слој је одсутан. До краја другог месеца почињу да се формирају плитке папиле и кожни апендици, веза између дермиса и епидермиса постаје јача. Литературни подаци указују да је трансплантација алогених кератиноцита на ране код пацијената са опекотинама обећавајућа метода. Упркос чињеници да се одбацивање алогених кератиноцита, према различитим ауторима, дешава у року од 10 дана до 3 месеца, они ипак играју своју улогу у зарастању површине ране, лучењу фактора раста и механичком затварању дефекта. Верује се да МПЦЛ имају смањену антигенску активност, јер током ин витро култивације губе Лангерхансове ћелије, што им омогућава да дуго постоје у телу примаоца. Поред тога, алогена култура добијена са коже младих здравих људи има неупоредиво већи биолошки потенцијал од аутологне културе пацијената након повреде.

Главни циљ наше студије био је да се утврди да ли ће се алогени кератиноцити примити на ожиљке и какве ће се промене догодити у ожиљном ткиву под утицајем таквог биолошки активног „премаза ране“. У случају позитивног резултата, да се развије најефикаснија и најмање радно интензивна технологија за ову област рехабилитационе медицине.

Подаци које смо добили били су у много чему слични подацима из литературе о морфолошким променама које се јављају у људском епидерму након трансплантације алогених кератиноцита на ране од опекотина. Међутим, постоје и значајне разлике, како у погледу морфолошке подлоге на коју се трансплантација одвија, тако и у погледу технологије. Тако се процес формирања базалне мембране и дермално-епидермалних веза (хемидесмозоми, папиле) одвија у каснијој фази у поређењу са трансплантацијом кератиноцита на површине ране без ожиљачких промена. Очигледно, ово се дешава због лошије исхране ожиљног ткива у поређењу са дермисом или мишићном фасцијом. Ожиљак, посебно стари, је густо везивно ткиво са веома малим бројем крвних судова, док је дно ране од опекотина гранулационо ткиво богато крвним судовима. Дакле, очигледно је да су услови под којима се одвија трансплантација и прихватање кератиноцита апсолутно различити. Што је подручје трансплантације ћелија васкуларизованије, то је процес њиховог прихватања лакши. Из овог постулата следи закључак о преференцији рада са младим ожиљцима, код којих је везивно ткиво још увек прилично растресито и богато крвним судовима.

Као резултат овог експерименталног рада доказано је да:

1. Трансплантација МПАЛК-а на ожиљке је могућа.
2. Оптимална метода трансплантације је трансплантација кератиноцита на покривач ране.
3. Површина ожиљка треба да се полира хируршком ласерском дермабразијом или Шумановим резачем.
4. Под утицајем МПАЛК-а долази до брзе епителизације полиране површине ожиљка.
5. Што је ожиљно ткиво боље васкуларизовано, односно што је ожиљак млађи, то су бољи резултати трансплантације кератиноцита.
6. Под утицајем трансплантираних кератиноцита, ожиљно ткиво се постепено трансформише и претвара у дермално (раскидивије ожиљно ткиво са кожним додацима).
7. Постепено отпуштање ожиљног ткива, почевши од субепидермалног слоја. Његова васкуларизација се побољшава, снопови колагенских влакана у горњем и доњем делу ожиљка добијају лабавији распоред него у ожиљном ткиву без трансплантације ћелија. Појављују се фоликули длаке и лојне жлезде. Епидермис се по својој структури, прошавши фазу хипертрофије, приближава епидермису нормалне коже.
8. Уочене промене су повезане са факторима раста и цитокинима које луче кератиноцити, а који, побољшавајући трофику ожиљног ткива, подстичу његову трансформацију из грубог фиброзног ткива у растреситије ткиво, што доводи до побољшања изгледа ожиљка.

Дакле, на основу ове студије, може се закључити да трансплантирани кератиноцити имају благотворно дејство на ожиљно ткиво, што може имати практичне импликације за рехабилитацију пацијената са различитим врстама ожиљака.

Овај рад на пацовима нам је такође омогућио да формулишемо захтеве за покриваче рана на којима се узгајају кератиноцити.

Завоји за ране треба да буду:

• биокомпатибилан са ћелијама,
• дишући,
• имају еластичну, обликујућу основу,
• бити хидрофилан,
• као лековити адитиви садрже антибактеријске лекове и антиоксиданте који нису токсични за култивисане ћелије.

Клинички резултати биотехнолошког третмана ожиљака.

Раније су Н. Карвер и др. (1993) открили да оклузивни завоји најбоље подстичу причвршћивање за рану и преживљавање кератиноцита, али не дозвољавају формирање слојевитог (зрелог) епидермиса. Ваздушна средина је неопходна за формирање слојевитог епидермиса. Стога је, након причвршћивања вишеслојног слоја, предложено да се оклузивни завој за рану уклони након 7-10 дана и ране третирају под сувим завојима или мастима растворљивим у води. Може се рећи да су квалитет и својства „подлоге“ на којој се ћелије гаје веома важна тачка за ефикасност трансплантације ћелијског материјала, а самим тим и за резултате рада лекара. Али данас не постоји идеалан завој за ране, упркос обиљу предложених опција (вештачка кожа, неткани материјал од карбоксиметил целулозе, фибрински премази, полупропусни полиуретански филмови). Важна тачка у овом питању је цена „подлога“ (специјалних прекривача за ране), јер њихова висока цена повећава укупне трошкове биотехнолошког третмана.

Ефикасност ћелијских технологија је до данас доказана, али, нажалост, ове технологије су веома скупе, посебно у земљама где није успостављена индустријска производња ћелијских композиција. Међутим, земље попут Сједињених Држава су одавно успоставиле индустрију за производњу ћелијског материјала за трансплантацију опекотина. Конкретно, компанија BioSurface Technology Inc. је од 1989. године узгајала 37.000 вишеслојних слојева кератиноцита, који су коришћени за лечење 240 пацијената у 79 земаља широм света (R. Odessey, 1992), док 1 cm 2 ћелијске културе ^кошта око 7-8 америчких долара.

Технологија лечења различитих кожних болести и проблема има низ разлика, али сваки ћелијски третман се заснива на добијању висококвалитетног ћелијског материјала и његовој трансплантацији.

Овај процес се састоји од следећих корака:

• узимање коже од жртава (или од донора),
• транспорт кожних режњева у биотехнолошки центар,
• изолација ћелија базалног слоја и њихова пролиферација,
• раст вишеслојних слојева кератиноцита (MLK).
• трансплантација ћелијске културе.

Главни проблем у спровођењу лечења трансплантацијом вишеслојних кератиноцитних листова је потреба за одрживим ћелијама у свим фазама трансплантације ћелија. Комадићи коже за изоловање аутологних или алогених ћелија треба да буду што тањи, јер их је у том случају лакше одвојити механичким и ензимским методама и добити суспензију живих ћелија за култивацију. Могу се добити сечењем дерматомом или коришћењем коже капака, препуцијума и унутрашње површине рамена. С обзиром на то да су ћелије осетљиве на халогене (хлор, јод), водоник-пероксид, не могу се користити приликом обраде коже током узимања материјала.

Квантитативни и квалитативни принос ћелија из кожних калемова и ефикасност њиховог узгоја такође зависе од здравља и старости донора. Поред тога, биопсије коже морају бити достављене што је брже могуће и под одговарајућим условима (окружење, температура) у лабораторију сертификовану и акредитовану за ове сврхе.

За складиштење и транспорт кожних режњева може се користити Иглов медијум или медијум 199 са додатком 10% говеђег серума, ДМЕМ медијум са додатком 5% феталног говеђег серума и антибиотика.

У цитолошкој лабораторији, биопсија коже се прво механички дели на мале комадиће, затим се комадићи коже обрађују помоћу ензима: трипсина, колагеназе, диспазе итд.

Под дејством ензима, десмозоми се уништавају и кератиноцити се ослобађају у медијум у облику појединачних ћелија или агрегата који се састоје од различитог броја ћелија. За култивацију се користе само базални кератиноцити, који се гаје на посебним медијумима у термостатима који садрже 5% CO2, у Петријевим шољама или у бочицама на t = 37°C. Већ након 48 сати, примећује се формирање колонија кератиноцита, које се постепено спајају и претварају у монослој. Након добијања довољног броја ћелија, добијена суспензија се посеје на завоје за ране припремљене за ову сврху и ставља у Петријеве шоље. Прво се из суспензије формира монослој, а затим вишеслојни слој кератиноцита. Фазе процеса култивације кератиноцита су шематски приказане на слици 12 (33,43,54,65).

Формирање вишеслојног слоја кератиноцита погодног за трансплантацију обично траје 7-10 дана. Понекад је овај период дужи, што зависи од квалитета изворног материјала (старости, здравственог стања донора, исправности прикупљања материјала, квалитета коришћених медијума итд.). Ако вишеслојни слој прерасте, онда се на његовој површини могу појавити ћелије са феноменима апоптозе непогодне за трансплантацију. Петријеве шоље са вишеслојним слојевима кератиноцита (МЛК) узгајаним у њима на покривачима за ране достављају се у клинику у посебним контејнерима на температури од најмање +15° Ц.

Модификована Гринова метода за узгој МПЦ-а

У нашем раду, користили смо вишеслојни камбрик као покривач за ране, напуштајући „Полипор“ фолије са којима смо почели да радимо у експерименту са пацовима. Тако смо узгајали вишеслојне слојеве кератиноцита на претходно одмашћеном и стерилном камбрику, иако ни он није оптималан покривач за ране.

Клиничке студије су спроведене на добровољцима уз поштовање неопходних етичких стандарда: потписивање споразума и информисаног пристанка.

1. Коришћена је култура пацијентових сопствених (аутологних) и складиштених (алогених) кератиноцита.
2. Кератиноцити пацијената су добијени из комада коже исеченог са унутрашње стране њихових надлактица.
3. Операција дермабразије ожиљака изведена је термокаутеризацијом, ротационим дисковима и ербијум ласером.
4. Узете су групе пацијената са нормотрофичним, хипотрофичним и хипертрофичним ожиљцима.

Технолошки процес примене ћелијске технологије за побољшање изгледа ожиљака на кожи састојао се од следећих фаза:

1. Избор пацијента.
2. Објашњења суштине третмана, временског оквира за добијање очекиваних резултата, потписивања уговора и информисаног пристанка.
3. Пацијентима 2-3 недеље пре операције прописати селмевит 1 таблету 3 пута дневно, цинктерал 1 таблету 3 пута дневно.
4. Узимање комада коже дужине 2,0 цм и ширине 0,7-1,0 цм са унутрашње површине рамена, високо, скоро у доњем делу аксиларне регије ради добијања аутологних кератиноцита.
5. У случајевима где су пацијенти одбили да изолују сопствене кератиноците због могућности линеарног ожиљка на унутрашњој површини рамена, ћелијски материјал је узет из ћелијске банке (алогени кератиноцити).
6. Кератиноцити су изоловани и узгајани у лабораторији сертификованој за ову врсту посла.
7. Након добијања довољне количине МПЦ-а за трансплантацију на ожиљке, заказан је дан за операцију у клиници, где је материјал донет у посебним контејнерима у Петријевим шољама.
8. Извршена је операција дермабразије ожиљака, хемостаза, полирана површина је испрана стерилним физиолошким раствором, осушена, након чега су МПК трансплантиране на њу на стерилном камбрику „ћелијама надоле“. То јест, ћелије које су биле горе у МПК испоставиле су се као ниже, поред полиране површине.
9. На врху је нанесена стерилна фолија, која је фиксирана за кожу еластичним завојем или еластичним Омнификс фластером. Уместо фолије могу се користити индиферентни завоји за ране који садрже силикон, на пример Мепител, Мепиформ, силиконске гел фолије.

После 5-7 дана, филм или силиконски премаз се уклања. До овог тренутка, сви кератиноцити би требало да су се попели на полирани ожиљак и причврстили за његову површину.

10. Влажна средина створена испод филма и силиконског премаза активно доприноси томе. Камбрик који остаје на ожиљку од ове тачке може се натопити куриозином или хитозанским гелом. Као резултат тога, другог дана се ствара густа кора, коју је, ради удобности пацијента, најбоље фиксирати еластичним, прозрачним фластером, као што је Омнификс. Прозрачна кора омогућава формираном епидерму да се диференцира и претвори у зрели.

У зависности од врсте ожиљка и дубине брушења, завој се одбацује након 8-10 дана. У овом тренутку, епидермис има 30-40% више ћелијских слојева него у нормалној кожи. Базална мембрана није формирана. Кератиноцити задебљаног епидермиса луче много биолошки активних молекула у ожиљно ткиво.

Успех биотехнолошког третмана ожиљака у великој мери зависи од начина неге у постоперативном периоду. Ћелијске културе су „нежни“ тип покривања рана и у раним фазама након трансплантације, ИПЦ-и се лако могу одлепити од основних ткива. Стога се пацијентима саветује да пажљиво рукују ожиљком након операције. Током 8-9 месеци не трљати и нежно третирати хладном прокуваном водом како би се избегло кидање танког, новоствореног епидермиса, који нема чврсту везу са основним ткивима.

Напомена.

Пре операције и током дермабразије, употреба халогенованих антисептика и оксиданата (јодопирон, сулиодопирон, јодинол, јодинат, хлорхексидин, водоник-пероксид) је дозвољена, пре трансплантације ћелија - строго је контраиндикована због њиховог цитотоксичног дејства. Метиленско плаво и бриљантно зелено су такође токсични за ћелије.

Да би се избегла инфекција, посебно при раду са хипертрофичним ожиљцима, хируршко поље се може третирати неомицин сулфатом, полимиксином или гентамицином. Они немају цитотоксични ефекат на кератиноците.

Као резултат таквог третмана постиже се троструки ефекат.

1. Изравнавање површине ожиљка.
2. Стварање слоја новог епидермиса нормалне дебљине изнад њега.
3. Трансформација ожиљног ткива у ткиво слично кожи услед дејства цитокина, фактора раста и других биолошки активних молекула које луче трансплантиране ћелије и које стимулишу кератиноците, фибробласте и макрофаге.

Ожиљак постаје мање приметан, еластичнији, у њему се појављују поре и велусна длака, а пигментација се може обновити због присуства меланоцита у МПК.

Међутим, сви ови позитивни аспекти ожиљка се не јављају одмах. У том смислу, потребно је упозорити пацијенте да се процес трансформације ожиљног ткива у дермално ткиво одвија споро и оптималан резултат таквог третмана може се очекивати најраније за 10-14 месеци. Одмах након одбацивања завоја, полиране површине имају изражену полихромију, што су светлије што је дубље полирање извршено. Најмање оштећење коже се примећује приликом полирања нормотрофних ожиљака ербијумским ласером. Боја ожиљака и околне коже је обновљена у року од 3 до 8 недеља. Упркос таквим мерама предострожности, понекад се јавља постоперативна хиперпигментација, која може сама нестати у року од неколико месеци.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]