Улога кристалних наслага у патогенези остеоартритиса

Кристали базног калцијум-фосфата (БЦП) налазе се у синовијалној течности код 30-60% пацијената са остеоартритисом. Према А. Свану и др. (1994), кристали који садрже калцијум налазе се у синовијалној течности код много већег броја пацијената са остеоартритисом; међутим, због изузетно мале величине кристала или њиховог малог броја, они се не идентификују конвенционалним техникама. Присуство кристала БЦП у синовијалној течности корелира са радиографским знацима дегенерације зглобне хрскавице и повезано је са већом запремином излива у поређењу са изливом у зглобовима колена без кристала. Студија фактора који утичу на радиографску прогресију гонартрозе показала је да је таложење кристала калцијум-пирофосфат-дихидрата (ЦППД) предиктор неповољног клиничког и радиографског исхода. У студији старијих пацијената, утврђено је да је остеоартритис повезан са хондрокалцинозом, посебно у латералном тибиофеморалном одељку колена и прва три метакарпофалангеална зглоба. Није неуобичајено да се обе врсте кристала, OFC и PFC, пронађу код пацијената са остеоартритисом.

Клинички, дегенерација зглобне хрскавице изазвана таложењем кристала калцијума разликује се од оне која се види код примарне остеоартрозе. Када би кристали били једноставан епифеномен дегенерације хрскавице, налазили би се у зглобовима који су најчешће погођени примарном остеоартрозом, тј. коленима, куковима и малим зглобовима шака. Насупрот томе, болести таложења кристала најчешће погађају зглобове који нису типични за примарну остеоартрозу, као што су раме, ручни зглоб и лакат. Присуство кристала у зглобној (изливној) течности повезано је са тежом дегенерацијом зглобне хрскавице. Расправља се о томе шта је узрок, а шта последица, таложење кристала или дегенерација хрскавице. Међупозицију заузима следећа претпоставка: примарна аномалија у метаболизму хрскавице доводи до њене дегенерације, а секундарно таложење кристала убрзава њену деградацију (тзв. теорија амплификационе петље).

Тачан механизам којим кристали калцијума оштећују зглобну хрскавицу није познат и сумиран је у наставку. Теоретски, кристали калцијума могу директно оштетити хондроците. Међутим, хистолошки преглед ретко открива кристале у близини хондроцита, а још ређе их они уносе. Највероватнији механизам је фагоцитоза кристала од стране ћелија синовијалне облоге, након чега следи ослобађање протеолитичких ензима или лучење цитокина који стимулишу ослобађање ензима од стране хондроцита. Овај концепт је поткрепљен студијом улоге синовитиса изазваног ПФКД у развоју брзо прогресивног остеоартритиса код пирофосфатне артропатије. У овој студији, кристали калцијум пирофосфат дихидрата (1 или 10 мг) су недељно убризгавани у десно колено зечева са остеоартритисом изазваним парцијалном латералном менисектомијом. Испоставило се да је након 8 ињекција десни зглоб колена показао знатно озбиљније промене у поређењу са левим. Интензитет синовијалне упале је био у корелацији са интраартикуларним ињекцијама кристала калцијум пирофосфат дихидрата и њиховом дозом. Упркос чињеници да дозе CPPD кристала коришћене у овој студији превазилазе оне in vivo, резултати указују на улогу CPPD-индуковане упале у прогресији остеоартритиса код пирофосфатне артропатије.

Потенцијални механизми индукције оштећења зглобне хрскавице кристалима који садрже калцијум повезани су са њиховим митогеним својствима, способношћу да индукују ММП и стимулишу синтезу простагландина.

Митогени ефекат кристала који садрже калцијум. Код артропанија повезаних са кристалима, често се примећује пролиферација ћелија синовијалне облоге, при чему су сами кристали само делимично одговорни за овај процес. Повећање броја синовијалних ћелија праћено је повећаном секрецијом цитокина, који подстичу хондролизу и индукују секрецију протеолитичких ензима. Кристали OFC у концентрацијама које се налазе у патологији људских зглобова зависно од дозе стимулишу митогенезу култура фибробласта коже у мировању и синовијалних фибробласта паса и миша. Кристали калцијум пирофосфат дихидрата, урата, сулфата, карбоната и калцијум фосфата стимулишу раст ћелија. Почетак и врхунац инкорпорације ( ^3H )-тимидина изазван овим кристалима померени су за 3 сата у поређењу са стимулацијом ћелија крвним серумом. Овај временски период може бити неопходан за фагоцитозу и растварање кристала. Додавање контролних кристала исте величине (нпр. дијамантска прашина или честице латекса) није стимулисало митогенезу. Кристали натријум-урата монохидрата имали су слаба митогена својства и били су значајно инфериорнији од оних калцијум-урата, што указује на важност садржаја калцијума у кристалима у митогенези. Синтетички OFC кристали имали су иста митогена својства као кристали добијени од пацијената са хондрокалцинозом. Митогени ефекат кристала који садрже калцијум није био резултат повећања садржаја калцијума у околној хранљивој подлози in vitro, јер растварање базних кристала калцијум-фосфата у хранљивој подлози није стимулисало уградњу ( ^3H )-тимидина од стране фибробласта.

Један предложени механизам за митогенезу индуковану OFC-ом је да абнормална пролиферација синовијалних ћелија може бити последица, барем делимично, ендоцитозе и интрацелуларног растварања кристала, што повећава цитоплазматске концентрације Ca2 ⁺ и активира пут зависан од калцијума који води до митогенезе. Овај концепт је поткрепљен потребом за директним контактом ћелија-кристал ради стимулације митогенезе, пошто је излагање ћелијских култура кристалима индуковало раст ћелија, док излагање ћелија лишених таквог контакта није. Да би се проучила потреба за фагоцитозом кристала након интеракције ћелија-кристал, ћелије су култивисане са ^45Ca -OPC и ( ^3H )-тимидином. Утврђено је да ћелије које садрже ^45Ca -OPC инкорпорирају значајно више ( ^3H )-тимидина него ћелије без обележавања базним калцијум фосфатом. У културама макрофага, инхибиција ендоцитозе кристала цитохалазином резултирала је инхибицијом растварања кристала, што додатно истиче неопходност фагоцитозе.

Кристали који садрже калцијум су растворљиви у киселини. Након фагоцитозе, кристали се растварају у киселој средини макрофагних фаголизозома. Хлорокин, амонијум хлорид, бафиломицин А1 и сви лизозомотропни агенси који повећавају pH вредност лизозома зависно од дозе инхибирају интрацелуларно растварање кристала и усвајање (3H)-тимидина ^у фибробластима култивисаним са базним кристалима калцијум фосфата.

Додавање OFC кристала у монослојну културу фибробласта изазвало је тренутно десетоструко повећање интрацелуларног калцијума, који се вратио на почетну вредност након 8 минута. Извор калцијума био је претежно екстрацелуларни јон, пошто су базни кристали калцијум фосфата додати у подлогу за култивацију без калцијума. Следеће повећање интрацелуларне концентрације калцијума примећено је након 60 минута и трајало је најмање 3 сата. Овде је извор калцијума били фагоцитовани кристали растворени у фаголизозомима.

Утврђено је да је митогени ефекат OFC кристала сличан оном код PDGF као фактора раста; попут овог другог, OFC кристали показују синергизам са IGF-1 и крвном плазмом. Блокада IGF-1 смањује ћелијску митогенезу као одговор на OFC. П. Г. Мичел и др. (1989) су показали да индукција митогенезе у Balb/c- ₃ T3 фибробластима _помоћу OFC кристала захтева присуство серин/треонин протеин киназе C (PKC), једног од главних медијатора сигнала генерисаних током спољашње стимулације ћелија хормонима, неуротрансмитерима и факторима раста. Смањење активности PKC у Balb/c-3 T3 ћелијама _{инхибираOFC} -посредовану индукцију протоонкогена c-fos и c-myc, али не утиче на стимулацију ових онкогена посредовану PDGF.

Повећање интрацелуларног калцијума након растварања фагоцитизованих кристала није једини сигнални пут за митогенезу. Када се фактори раста, попут PDGF, вежу за свој мембрански рецептор, стимулише се фосфолипаза C (фосфодиестераза), која хидролизује фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат и формира интрацелуларне гласнике инозитол-3-фосфат и диацилглицерол. Први ослобађа калцијум из ендоплазматског ретикулума модулирањем активности ензима зависних од калцијума и зависних од калцијума/калмодулина, као што су протеин киназе и протеазе.

Р. Ротенберг и Х. Чеунг (1988) су известили о повећаној разградњи фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата фосфолипазом Ц у синовијалним ћелијама зечева као одговор на стимулацију OFC кристалима. Потоњи су значајно повећали садржај инозитол-1-фосфата у ћелијама са обележеним ( ^3H )-инозитолом; врх је достигнут у року од 1 минута и трајао је око 1 сат.

Диацилглицерол је потенцијални активатор калцијум пирофосфат дихидрата. Пошто OFC кристали повећавају активност фосфолипазе C, што доводи до акумулације диацилглицерола, последично се може очекивати повећање активације PKC. П. Г. Мичел и др. (1989) упоредили су ефекте OFC кристала и PDGF на синтезу ДНК од стране Balb/c- _{3T3фибробласта}. У ћелијској култури, PKC је инактивиран инкубацијом ћелија са форбол диестром (TPD) који подржава тумор, аналогом диацилглицерола. Дуготрајна стимулација ниским дозама TPD смањила је активност PKC, док ју је једнократна стимулација високом дозом активирала. Стимулација синтезе ДНК OFC кристалима је потиснута након инактивације PKC, што указује на важност овог ензима у митогенези индукованој OFC. Раније су Г. М. Макарти и др. (1987) показали везу између митогеног одговора људских фибробласта на OFC кристале и активације PKC. Међутим, OFC кристали не активирају фосфатидилинозитол 3-киназу или тирозин киназе, што потврђује да је механизам активације ћелија OFC кристалима селективан.

Ћелијску пролиферацију контролише група гена названих прото-онкогени. Протеини foe и mye, производи прото-онкогена c-fos и c-myc, локализовани су у ћелијском једру и везани за специфичне ДНК секвенце. Стимулација 3T3 фибробласта OFC кристалима резултира експресијом c-fos у року од неколико минута, која достиже максимум 30 минута након стимулације. Индукција c-myc транскрипције OFC кристалима или PDGF-ом се јавља у року од 1 сата и достиже максимум 3 сата након стимулације. Ћелије одржавају повишен ниво c-fos и c-myc транскрипције најмање 5 сати. У ћелијама са инактивираним PCD-ом, стимулација c-fos и c-myc OFC или TFD кристалима је значајно потиснута, док се индукција ових гена помоћу PDGF-а не мења.

Чланови породице митоген-активираних протеин киназа (MAP K) су кључни регулатори различитих интрацелуларних сигналних каскада. Једна подкласа ове породице, p42/p44, регулише ћелијску пролиферацију путем механизма који укључује активацију прото-онкогена c-fos и c-jun. Кристали OFC и PFKD активирају сигнални пут протеин киназе који укључује и p42 и p44, што сугерише улогу овог пута у митогенези индукованој кристалима који садрже калцијум.

Коначно, митогенеза индукована OFC-ом укључује транскрипциони фактор нуклеарни фактор κB (NF-κB), који је први пут описан као ген лаког ланца имуноглобулина κ (IgK). То је индуцибилни транскрипциони фактор важан у многим сигналним путевима јер регулише експресију различитих гена. Индукција NF-κB је обично повезана са ослобађањем инхибиторних протеина названих IκB из цитоплазме. Индукцију NF-κB прати транслокација активног транскрипционог фактора у једро. Кристали OFC-а индукују NF-κB у Balb/c- _3T3 фибробластима и фибробластима људске коже.

Неколико путева може бити укључено у пренос сигнала након активације NF-κB, али сви укључују протеин киназе које фосфорилују (и тиме разграђују) IκB. На основу in vitro студија, раније се сматрало да IκB служи као супстрат за киназе (нпр. PKC и протеин киназу А). Међутим, недавно је идентификован комплекс IκB киназе велике молекулске тежине. Ове киназе специфично фосфорилују серинске остатке IκB. Активација NF-κB помоћу TNF-α и IL-1 захтева ефикасно дејство NF-κB-индукујуће киназе (NIK) и IκB киназе. Молекуларни механизам активације NIK тренутно није познат. Иако OFC кристали активирају и PKC и NF-κB, степен у којем ова два процеса могу бити повезана није познат. Пошто се модификација GκB киназе одвија путем фосфорилације, улога PKC у индукцији NF-κB помоћу OFC кристала путем фосфорилације и активације GκB киназе не може се искључити. Овај концепт је поткрепљен инхибицијом митогенезе индуковане кристалима OFC-а и експресије NF-κB помоћу инхибитора PKC, стауроспорина. Слично томе, стауроспорин може инхибирати GκB киназу, и тако инхибира протеин киназу А и друге протеин киназе.

Дакле, механизам митогенезе индуковане OFC-кристалима у фибробластима укључује најмање два различита процеса:

• брзи мембрански догађај који доводи до активације PKC и MAP K, индукције NF-κB и прото-онкогена,
• спорије интрацелуларно растварање кристала, што доводи до повећања интрацелуларног садржаја Ca ²⁺, а затим и до активације низа процеса зависних од калцијума који стимулишу митогенезу.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Индукција кристалима који садрже ММП-калцијум

Медијатори оштећења ткива кристалима који садрже калцијум су ММП - колагеназа-1, стромелизин, желатиназа од 92 kD и колагеназа-3.

С обзиром на везу између садржаја кристала OFC-а и разарања зглобног ткива, постављена је хипотеза да кристале OFC-а, а могуће и неке колагене, фагоцитују синовијалне ћелије. Стимулисани синовоцити пролиферишу и луче протеазе. Ова хипотеза је тестирана in vitro додавањем природних или синтетичких OFC, PFCD и других кристала култивисаним људским или псећим синовоцитима. Активност неутралних протеаза и колагеназа повећавала се зависно од дозе и била је приближно 5-8 пута већа од активности контролне ћелијске културе узгајане без кристала.

У ћелијама култивисаним у медијуму који садржи кристале, откривена је коиндукција колагеназе-1, стромелизина и желатиназе-92 kDa mRNA, након чега је уследила секреција ензима у медијум.

Кристали OFC су такође индуковали акумулацију иРНК колагеназе-1 и колагеназе-2 у зрелим свињским хондроцитима, након чега је уследила секреција ензима у медијум.

ГМ Макарти и др. (1998) су проучавали улогу интрацелуларног растварања кристала у кристално индукованој производњи ММП-а. Повишење лизозомалног pH помоћу бафиломицина А инхибирало је интрацелуларно растварање кристала, а такође је ослабило пролиферативни одговор људских фибробласта на кристале OFC-а, али није инхибирало синтезу и секрецију ММП-а.

Ни базни калцијум фосфат нити PFCD кристали нису индуковали производњу IL-1 in vitro, али кристали натријум урата јесу.

Тренутни подаци јасно указују на директну стимулацију производње ММП од стране фибробласта и хондроцита након контакта са кристалима који садрже калцијум.

Симптоми остеоартритиса указују на значајну улогу ММП-а у прогресији болести. Присуство кристала који садрже калцијум повећава дегенерацију ткива погођених зглобова.

Стимулација синтезе простагландина

Уз стимулацију раста ћелија и лучење ензима, кристали који садрже калцијум изазивају ослобађање простагландина из ћелијских култура сисара, посебно ПГЕ2 _. Ослобађање ПГЕ2 се _{у свим случајевима дешава у року од првог сата након излагања ћелија кристалима. Р. Ротенберг (1987) је утврдио дасу} главни извори арахидонске киселине за синтезу ПГЕ2 фосфатидилхолин и фосфатидилетаноламин, а такође је потврдио да су фосфолипаза А2 _и НОХ доминантни путеви за _{производњу} ПГЕ2.

ПГЕ1 се такође може ослободити као одговор на кристале ОФА. Г. М. Мекарти и др. (1993, 1994) проучавали су ефекте ПГЕ2 _, ПГЕ и његовог аналога мизопростола на митогени одговор људских фибробласта на кристале ОФА. Сва три агенса су инхибирала митогени одговор на начин зависан од дозе, при чему су ПГЕ и мизопростол показивали израженију инхибиторну активност. ПГЕ2 и мизопростол, али не и ПГЕ2 _, инхибирали су акумулацију иРНК колагеназе као одговор на кристале ОФА.

М. Г. Макарти и Х. Чеунг (1994) истраживали су механизам активације ћелија посредоване OFC-ом помоћу PGE. Аутори су показали да PGE, снажнији индуктор интрацелуларног цАМП-а од PGE2 _и PGE, инхибира OFC-индуковану митогенезу и производњу MMP-а путем cAMP-зависног пута преноса сигнала. Могуће је да повећање производње PGE индуковано OFC кристалима слаби њихове друге биолошке ефекте (митогенезу и производњу MMP-а) путем механизма повратне спреге.

Упала изазвана кристалима

Кристали који садрже калцијум се често налазе у синовијалној течности пацијената са остеоартрозом, међутим, епизоде акутне упале са леукоцитозом су ретке и код остеоартрозе и код артропатија повезаних са кристалима (на пример, Милвокијски синдром рамена). Флогистички потенцијал кристала може бити модификован бројним инхибиторним факторима. Р. Теркелтауб и др. (1988) су показали способност крвног серума и плазме да значајно инхибирају одговор неутрофилних гранулоцита на базне кристале калцијум фосфата. Фактори који изазивају такву инхибицију су протеини који везују кристале. Студија једног од ових протеина, ₂ -HS гликопротеина (AHSr), показала је да је AHSр најпотентнији и најспецифичнији инхибитор одговора неутрофилних гранулоцита на OFC кристале. AHSr је серумски протеин јетреног порекла; Познато је да се, у поређењу са другим серумским протеинима, налази у релативно високим концентрацијама у костима и минералишућем ткиву. Поред тога, AHSr је присутан у „неупаљеној“ синовијалној течности и такође је детектован на базним кристалима калцијум фосфата у нативној синовијалној течности. Стога се не може искључити могућност да AHSr модулира флогогени потенцијал базичних кристала калцијум фосфата in vivo.

Да сумирамо све горе наведено, представљамо две шеме патогенезе остеоартритиса које су предложили ВБ ван ден Берг ет ал. (1999) и М. Царрабба ет ал. (1996), који комбинују механичке, генетске и биохемијске факторе.