Дијагноза херпеса

Дијагноза херпеса заснива се на класичној изолацији вируса на осетљивим ћелијским културама, имунофлуоресцентним и серолошким методама, колпоскопском прегледу и коришћењу савремених молекуларно-биолошких метода (ПЦР, тачкаста хибридизација), што омогућава дијагностиковање целе групе херпес вируса, укључујући типове HHV-6 и HHV-7.

Лабораторијске дијагностичке методе за херпес инфекцију

Главне методе усмерене на изоловање HSV-а или детекцију вирусних честица и/или њихових компоненти	Помоћне методе усмерене на откривање антитела на HSV у биолошким течностима људског тела
Изолација HSV-а у осетљивим ћелијским и животињским културама Директна и имунолошка електронска микроскопија Директне и индиректне варијанте IPA ИФА Молекуларно-биолошке методе Реакција аглутинације латекса	Реакција неутрализације РСК Одређивање антитела на неструктурне протеине HSV-1,2

Показано је да је код 76% пацијената генитални херпес (ГХ) узрокован HSV-2, а код 24% - HSV-1 типом. Штавише, ГХ као моноинфекција се јавио само код 22% пацијената, док су у 78% случајева откривене микробне асоцијације. Код 46% особа откривена је паразитоценоза изазвана са два патогена, укључујући хламидију која је откривена у 40% случајева. Гарднерела, трихомонада и гонококе су ређе откривене у брисевима.

Код 27% пацијената, паразитоценозу су представљала три патогена, код 5,2% - четири патогена. Штавише, најчешће је примећена комбинација хламидије са гарднерелом и гљивицама Candida. Ови подаци поткрепљују потребу за темељним бактериолошким прегледом пацијената са ГХ како би се идентификовале комбинације патогених агенаса, као и детаљним проучавањем патогенезе мешовитих инфекција урогениталног тракта, што ће омогућити диференцирану комплексну терапију херпесне инфекције.

Материјали проучавани за изолацију HSV-а у зависности од локализације херпетичних лезија

Локализација лезија	Садржај везикула	Сквргавање ћелија				Лишајна течност (CSF)	Бронхијални аспират	Биопсија	Крв
		1	2	3	4
Кожа	+								+
Очи			+						+
Гениталије				+					+
Анус	+				+				+
Уста	+	+							+
ЦНС	+					+		+	+
Плућа		+					+		+
Јетра								+	+
Конгенитални херпес	+	+	+				+		+

Методе лабораторијске дијагностике цитомегаловирусне инфекције

Методе	Време потребно за добијање резултата	Белешке
ВИРОЛОШКИ
Електронска микроскопија	3 сата	Није баш приступачно
Изолација вируса у ћелијској култури (VCI)	4-20 дана	Стандардно, Споро
Имунофлуоресцентно бојење ране АГ употребом моноклонских антитела	6 сати	Мање специфично
ЦИТОЛОШКИ	2-3 сата	Мање специфично
СЕРОЛОШКИ
РСК	2 дана	Стандардно
РГА	1 дан	Радно интензивно
ГРЕБЕН	6 сати	Једноставно, специфично
НРИФ	6 сати	Тешко
РИМП	6 сати	Тешко
ЕЛИСА (ИгМ, ДО)	6 сати	Брзо, једноставно
Имуноблот	6 сати	Скупо
МОЛЕКУЛАРНИ БИОЛОШКИ
МГ	5-7 дана	Скупо, радно интензивно
ПЦР	3 сата	Скупо

Методе дијагностике вируса херпес зостер

Дијагностичке методе	Лабораторијске технике
ИНДИРЕКТНО
Избор	Култура ткива, пилећи ембриони, лабораторијске животиње, ко-култура са пермисивним ћелијама или помоћним вирусима
Идентификација изолата	Реакција неутрализације, RSC, IF, PIEF, реакција преципитације изолата, аглутинација, IF
ДИРЕКТНО
Цитологија	Размази: имунофлуоресценција у боји
Хистологија	Патоморфологија ћелије
Структура	Ембрионална микроскопија, имуноелектронска микроскопија
Одређивање антигена	ИФ, ПИЕФ, РИМ, ИФА
Одређивање локалне производње антитела	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Молекуларно биолошки приступи	Молекуларна хибридизација, ПЦР

Лабораторијска дијагностика инфекције изазване вирусом херпес зостер

Дијагностички проблеми	Методе	Очекивани резултати
Акутна примарна инфекција	1	Детекција за 2 сата
	2	Нивои антитела полако расту
	3	Појављује се 3 дана након инфекције
Акутна реактивирана инфекција	1	Детекција UUU након 2 сата
	2	Нивои антитела полако расту
	4	Појављује се 4 дана након појаве осипа

1. одређивање везикула VEGF-а у течности;
2. серологија: CSC, ELISA, усмерена на детекцију
3. серологија: ELISA усмерена на детекцију IgM;
4. серологија: ELISA тест усмерен на детекцију IgA, IgM.

Методе за индикацију имуног одговора на инфекцију вирусом херпес зостер

Приступ	Метод
Детекција повећања титра антитела у другом серумском узорку	RSK, RTGA, RPGA, IF реакција неутрализације, RIM, ELISA
Детекција антитела специфичних за класу Ig G и Ig A у првом узорку серума	ELISA, IF, RIM, латекс аглутинација

Тумачење резултата серолошког испитивања серума пацијената на херпесвирусне инфекције (ELISA)

Назив инфекције/маркера	Просечне праговне вредности за инфекције
	Резултати анализе	Тумачење
Цитомегалија Анти-CMV IgG (1-20 U/ml) Анти-ЦМВ ИгМ (100-300%)	Позитивно 1-6 Позитивно 6-10 Позитивно >10 Негативно Позитивно 100-300 Негативно <90 Сумњиво 90-100	Ремисија Погоршање болести Акутна фаза болести Нема инфекције (болести) Акутна фаза болести Поновити анализу за 2-3 недеље
Херпес симплекс 1,2 серотипа Анти-HSV 1/2 укупно (100-900%)	Позитивно 100-400 Позитивно 400-800 Позитивно >800 Негативно <100	Ремисија Погоршање болести Акутна фаза болести Нема инфекције (болести)

У табели су приказане главне методе лабораторијске дијагностике херпесвирусних инфекција, као и препоручени биолошки материјали који се испитују приликом изоловања ХСВ-а, узимајући у обзир локализацију херпетичних лезија.

Поуздано изоловање вируса херпес симплекса и ЦМВ инфицирањем осетљивих ћелијских култура. Тако је током вирусолошког прегледа 26 пацијената током периода рецидива, HSV изолован на осетљивој Vero ћелијској култури у 23 случаја (88,4%). Инфициране културе су показале слику цитопатског дејства типичног за HSV - формирање вишеједарних џиновских ћелија или акумулацију заобљених и увећаних ћелија у облику кластера. У 52,1% случајева, жаришта цитопатског дејства вируса могла су се детектовати већ 16-24 сата након инфекције. До 48-72 сата инкубације инфицираних култура, проценат материјала који изазивају специфично уништење ћелија повећао се на 87%. А само у 13% случајева позитивни резултати су откривени 96 сати након инфекције или више или током поновљеног пасирања.

Методе лабораторијске дијагностике генерализоване херпесне инфекције

Главне методе усмерене на откривање (изоловање) херпес вируса, њихових честица и њихових компоненти	Помоћне методе усмерене на откривање антитела на херпес вирусе у биолошким течностима, откривање ензимских померања у крвном серуму
Изолација херпес вируса на осетљивим ћелијским и животињским културама Директна и имунолошка електронска микроскопија Директне и индиректне варијанте имунопероксидазне методе Директне и индиректне варијанте методе флуоресцентних антитела Варијанте чврстофазног ензимског имунотестa Варијанте методе молекуларне (ДНК-ДНК) хибридизације Ланчана реакција полимеразе Реакција латекс аглутинације	Тест неутрализације Тест фиксације комплемента Тест латекс аглутинације Индиректна верзија методе флуоресцентних антитела Индиректна верзија методе имунопероксидазе Варијанте чврстофазног ензимског имунотестa Метода имунолошког блотинга Метода радијалне фиксације комплемента Одређивање нивоа аланин и аспартат аминотрансферазе

Серолошке методе се користе за дијагностиковање инфективне мононуклеозе (инфекције изазване ЕПВ). Пол-Банелова реакција са овновским еритроцитима, дијагностички титар од 1:28 или већи у једном тесту крвног серума или 4 пута већа количина антитела при испитивању упарених серума. Користи се Хоф-Бауерова реакција са 4% суспензијом формалинизованих коњских еритроцита. Резултат се узима у обзир након 2 минута; код инфективне мононуклеозе реакција је високо специфична.

Тренутно се развија метода ензимског имунотестовања (ЕИА) за дијагностиковање инфективне мононуклеозе. У овом случају, антитела IgG и IgM у серуму пацијента се одређују инкубацијом са лимфобластима инфицираним ЕПВ-ом, након чега следи третман флуоресцентним антителима. У акутном периоду болести, антитела на вирусни капсидни антиген се одређују у титру од 1:160 и више.

Приликом коришћења бројних увезених комерцијалних тест система, ELISA може да детектује: антитела на антитела омотача EBV-а, антитела на рани антиген EBV-а, укупна антитела на рани антиген EBV-а, одређена у акутној фази болести и у једру и у цитоплазми ћелија, и ограничена антитела на рани EBV, одређена у акутној фази болести и у једру и у цитоплазми ћелија, ограничена антитела на рани антиген EBV-а, одређена на врхунцу болести само у цитоплазми ћелија, и антитела на нуклеарни антиген EBV-а. Употреба ових тест система омогућава диференцијалну дијагностику бројних болести повезаних са EBV-ом.

Након позитивног ELISA теста који открива антитела на EBV, врши се потврдна имуноблотинг реакција, којом се утврђује присуство антитела на појединачне EBV маркер протеине (p-протеине): p23, p54, p72 (присуство овог протеина указује на могућност репродукције EBV), p 138. Горе наведене лабораторијске методе се такође користе за праћење ефикасности лечења.

Осетљивост вирусолошких метода је 85-100%, специфичност је 100%, време проучавања је 2-5 дана. У практичном раду се често користи метода директне имунофлуоресценције (ДИФ) са поликлоналним или моноклоналним антителима против HSV-1 и HSV-2. ДИФ метода се прилично лако репродуцира у редовној клиничкој лабораторији, није скупа, осетљивост је изнад 80%, специфичност је 90-95%. Имунофлуоресцентна микроскопија је открила присуство цитоплазматских инклузија, морфолошке карактеристике, проценат инфицираних ћелија у брисевима-стругањима из уретре, цервикалног канала, грлића материце, ректума.

ПИФ метода пружа представу о морфолошким својствима ћелија и променама у локализацији ХСВ антигена. Поред директних знакова оштећења ћелија херпес вирусима (детекција специфичне луминесценције), постоје и индиректни знаци херпесне инфекције према ПИФ подацима:

• агрегација нуклеарне материје, одвајање кариолеме;
• присуство такозваних „рупастих“ језгара, када из ћелијског једра остаје само једна кариолема;
• присуство интрануклеарних инклузија - Каудријева тела.

Приликом извођења ПИФ-а, лекар добија не само квалитативну већ и квантитативну процену стања инфицираних ћелија, коју смо користили за процену ефикасности антивирусне терапије ацикловиром (АЦ). Тако је 80 пацијената са једноставним гениталним херпесом (ГХ) прегледано ПИФ методом у динамики. Показано је да ако је пре лечења ацикловиром 88% пацијената имало висок проценат инфицираних ћелија (50-75% и више) у брисевима, онда су након једног курса ацикловира здраве ћелије откривене у брисевима 44% пацијената, у 31% случајева примећене су појединачне инфициране ћелије, а код 25% пацијената било је до 10% инфицираних ћелија.

Садржај инфицираних ћелија у брисевима (ПИФ реакција) пацијената са гениталним херпесом лечених ацикловиром

Периоди болести	Процентуални садржај у размазима
	Заражене ћелије					Нормалне ћелије
	Више од 75%	50-75%	40-50%	10%	Појединачне ћелије у видном пољу
Рецидив (пре лечења)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Ремисија (након лечења)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Користећи ПИФ и метод тачкасте хибридизације током дуги низ година, примећено је да се резултати студије поклапају у скоро 100% случајева. Треба напоменути да се ради повећања поузданости дијагнозе херпеса, посебно у случајевима субклиничких и ниско манифестних облика херпеса, препоручује коришћење 2-3 методе лабораторијске дијагностике у раду, посебно приликом прегледа трудница, жена са неповољном акушерском историјом и особа са неодређеном гинеколошком дијагнозом.

Дакле, у ПЦР дијагностици вирусних и бактеријских инфекција урогениталног тракта, неопходно је проценити добијене позитивне резултате узимајући у обзир анамнезу, присуство (или одсуство) специфичних клиничких симптома болести. Ако се хламидија открије помоћу ПЦР-а, онда у том случају постоји велика вероватноћа инфекције и питања терапије се могу решити у складу са тим. У случају откривања микоплазми (уреаплазми), које су опортунистички микроорганизми, потребна су додатна културолошка испитивања ради потврде дијагнозе, тј. сетва материјала од пацијента на осетљиве ћелијске културе. Само ако се у културолошкој анализи добију позитивни резултати, можемо говорити о лабораторијској потврди дијагнозе микоплазмозе. Иста метода ће омогућити, ако је потребно, да се утврди осетљивост изолованих микоплазми на често коришћене дозне облике (антибиотици, флуорокинолони итд.).

Могућа је истовремена инфекција са неколико вируса из породице Herpesviridae. Често смо детектовали инфекцију једног пацијента вирусима HSV-1, HSV-2 и CMV. Пацијенти са клиничким и лабораторијским манифестацијама секундарног ИДС-а (онкохематолошки, онколошки, ХИВ-инфицирани пацијенти) били су значајно чешће инфицирани са неколико херпес вируса. Дакле, показано је да клинички и имунолошки поремећаји који напредују у ХИВ инфекцији прате повећање броја херпес вируса детектованих методом молекуларне хибридизације. У овом случају, прогностички најзначајнијим може се сматрати комплексно истовремена детекција ДНК типа HSV-1, CMV и HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]